前言

輸尿管狹窄可由輸尿管損傷、放療、輸尿管結(jié)石、尿路感染和輸尿管子宮內(nèi)膜異位癥引起，通常需要進(jìn)行輸尿管重建。雖然組織工程、自體組織移植和應(yīng)用各種皮瓣的手術(shù)技術(shù)已經(jīng)被用于輸尿管再生，且都取得了一定的成功，但每種方法都各有其優(yōu)缺點(diǎn)。

近日來(lái)自日本長(zhǎng)崎大學(xué)的Katsunori Takagi團(tuán)隊(duì)在《Acta Biomaterialia》雜志發(fā)表了Regeneration of the ureter using a scaffold-free live-cell structure created with the bio-three-dimensional printing technique一文，探索了輸尿管再生的新方法。

一、背景

急性輸尿管損傷占術(shù)中損傷的80%（其余20%是外傷所致），可引起瘺管形成和腎盂積水，導(dǎo)致輸尿管狹窄。放射治療、輸尿管結(jié)石、尿路感染和輸尿管子宮內(nèi)膜異位癥也可引起這種輸尿管狹窄。另外，兒童可能會(huì)患有先天性輸尿管狹窄、先天性輸尿管梗阻和其他需要輸尿管重建的疾病。

目前，使用可生物降解的聚合物通過(guò)組織工程進(jìn)行輸尿管再生是最先進(jìn)的尿路和輸尿管重建技術(shù)。盡管使用具有高生物相容性的材料已經(jīng)取得了一些結(jié)果，但可能出現(xiàn)腎盂積水和移植物感染等并發(fā)癥，因此這種方法尚未在臨床上應(yīng)用。

自體靜脈移植也取得了良好的效果。由于這種技術(shù)使用自體組織，不需要擔(dān)憂免疫抑制問(wèn)題，唯一的缺點(diǎn)是需要從正常部位提取移植物。然而，使用這種方法是否有可能進(jìn)行長(zhǎng)節(jié)段重建尚不清楚。因此，尚未在臨床上應(yīng)用。

雖然臨床上最可靠的方法是輸尿管部分切除和端到端吻合，但隨著切除輸尿管尺寸的增加，需要手術(shù)重建，如使用回腸導(dǎo)管或膀胱壁的Boari皮瓣手術(shù)。然而，使用回腸導(dǎo)管需要腸切除和尿路改變，具有高侵入性，且并發(fā)癥發(fā)生率高。而使用膀胱壁需要先進(jìn)的外科手術(shù)，很少有外科醫(yī)生能夠完成。

因此，需要探索替代上述手術(shù)方法的方法。研究團(tuán)隊(duì)之前已經(jīng)使用無(wú)支架的細(xì)胞結(jié)構(gòu)再生了管腔器官，如氣管和食道，并取得了良好的效果。在本研究中，研究團(tuán)隊(duì)試圖使用僅由活細(xì)胞組成的人工輸尿管來(lái)再生活大鼠的輸尿管。

二、材料制備

1. 細(xì)胞培養(yǎng)

本研究采用正常的人皮膚成纖維細(xì)胞（NHDFs）和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）。將人皮膚成纖維細(xì)胞置于DMEM培養(yǎng)基和Ham’s F-12 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加入胎牛血清素和100U/mL鏈霉素-兩性霉素B。將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞置于內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基2（EGM-2）中培養(yǎng)，加入人表皮生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、R3胰島素樣生長(zhǎng)因子1、抗壞血酸、氫化可的松、人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子堿性、肝素、胎牛血清和慶大霉素-兩性霉素-B。

2. 球狀體產(chǎn)生

將由90%NHDFs和10%HUVECs組成的3.5×106個(gè)細(xì)胞每毫升的懸濁液加入到超低吸附的圓形96孔板上，每個(gè)孔中加入100微升。將孔板置于37攝氏度的加濕環(huán)境下培養(yǎng)，環(huán)境二氧化碳濃度約為5%。72小時(shí)后，細(xì)胞形成500-700微米大小的球體。

3. 人工輸尿管的構(gòu)建

人工輸尿管結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)與連接正常大鼠輸尿管的吻合口相吻合，小軸為0.7-0.9mm。總共有12層球狀體堆疊在一個(gè)3×3微針陣列（稱為Kenzan）主軸約為7mm，直徑約為1.5mm。使用RegenovaBio-3D打印機(jī)將球狀體層壓成這個(gè)人工輸尿管結(jié)構(gòu)，并使用“Kenzan方法”將細(xì)胞串到微針陣列上。然后，將該結(jié)構(gòu)放置在一個(gè)裝有等量成分的DMEM/Ham’sF12和EGM-2的生物反應(yīng)器中培養(yǎng)一周。隨后，從 Kenzan支架上取出人工結(jié)構(gòu)，在顯微鏡下將一個(gè)外徑為0.3mm、內(nèi)徑為0.2mm的硅支架插入其中心。為了促進(jìn)球狀體之間的融合并增加它們的強(qiáng)度，將插入硅支架的結(jié)構(gòu)在循環(huán)培養(yǎng)中返回到生物反應(yīng)器中，再進(jìn)行7周或更長(zhǎng)的時(shí)間培育。

三、實(shí)驗(yàn)部分

本研究使用了13只雄性F344大鼠，每只體重260-400g。大鼠隨機(jī)分為5組：2周安樂(lè)死組（n=3）、4周安樂(lè)死組（n=3）、8周安樂(lè)死組（n=3）、12周安樂(lè)死組（n=1）和硅膠支架組（n=3）。

給大鼠吸入異氟醚進(jìn)行麻醉，然后肌肉注射劑量為100mg/kg的氯胺酮。在腹部中線切口，露出左側(cè)輸尿管。顯微鏡下解剖輸尿管。輸尿管殘端腎側(cè)和膀胱側(cè)之間的距離約為2mm。然后，將帶有硅支架的人工輸尿管結(jié)構(gòu)插入輸尿管腎和膀胱兩側(cè)約5mm，用尼龍線縫合輸尿管兩端并固定在輸尿管壁上。人工輸尿管在循環(huán)過(guò)程中收縮成約2毫米的球形結(jié)構(gòu)。將人工結(jié)構(gòu)和正常大鼠輸尿管吻合。為了加強(qiáng)移植的結(jié)構(gòu)，在其周?chē)蝺傻卫w維蛋白膠，然后封閉腹膜，縫合腹壁完成手術(shù)。

移植完成后，大鼠皮下注射他克莫司(0.5mg/kg)，每天應(yīng)用這種免疫抑制治療，直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

四、實(shí)驗(yàn)分析

1. 宏觀與組織病理學(xué)分析

在移植前對(duì)人工輸尿管結(jié)構(gòu)進(jìn)行了組織病理學(xué)評(píng)估。這些結(jié)構(gòu)用甲醛固定，并用石蠟包埋。石蠟包埋組織的超薄切片用蘇木精和伊紅、抗泛細(xì)胞角蛋白和抗VEGFA染色（如圖4B）。并記錄在移植過(guò)程中，人工輸尿管的形態(tài)變化。

分別在人工輸尿管移植后2、4、8、12周處死大鼠，并進(jìn)行宏觀和組織病理學(xué)評(píng)估。首先，觀察采用人工輸尿管結(jié)構(gòu)移植的輸尿管，并記錄其蠕動(dòng)狀態(tài)。接下來(lái)，在移植結(jié)構(gòu)的膀胱側(cè)進(jìn)行解剖，確認(rèn)是否有尿流出。取出移植部分及兩側(cè)的正常輸尿管，切除移植部分。最后，取左右腎，從中間剖開(kāi)，根據(jù)胎兒泌尿?qū)W學(xué)會(huì)分級(jí)評(píng)估腎積水程度。

在評(píng)估每個(gè)項(xiàng)目后，將移植的結(jié)構(gòu)、正常輸尿管和左右腎用甲醛固定，并用石蠟包埋。石蠟包埋組織的超薄切片分別用蘇木精和伊紅以及抗尿苷、抗泛細(xì)胞角蛋白、抗平滑肌肌動(dòng)蛋白、抗VEGFA和抗細(xì)胞角蛋白-14染色，分別用于組織病理學(xué)和免疫組化分析。另外，對(duì)移植的結(jié)構(gòu)進(jìn)行Masson三色染色。

2. 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

研究團(tuán)隊(duì)比較了人工輸尿管結(jié)構(gòu)組（n=10）和僅使用支架治療組（n=3）的整體腎積水程度。此外，測(cè)量了輸尿管的直徑，以比較健康輸尿管（n=5）和再生輸尿管（n=4）的橫截面積，以估計(jì)尿流量。使用JMPPro軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)和Welch的t檢驗(yàn)。

五、結(jié)論

1. 宏觀分析

所有大鼠在移植后體重均有所下降，在本實(shí)驗(yàn)的12周的過(guò)程中，沒(méi)有實(shí)驗(yàn)鼠死亡。移植時(shí)，人工輸尿管結(jié)構(gòu)呈球形（如圖5 A,E,I,M）。在動(dòng)物死亡時(shí)，人工輸尿管已經(jīng)粘附在周?chē)慕M織上。因此，這些結(jié)構(gòu)的周邊需要被小心地剝離。在移植時(shí)，第2、4、8、12周時(shí)的人工輸尿管結(jié)構(gòu)均小于移植時(shí)（如圖5B,F,J,N）。

移植輸尿管側(cè)的腎臟幾乎與未接觸輸尿管的一側(cè)的健康腎臟大小相同(如圖5C,G,K,O)。在第4周處死的大鼠中，雙腎切面顯示腎盂輕微擴(kuò)張，對(duì)應(yīng)于腎盂1級(jí)積水(如圖5H).然而，在第2、8和12周處死的動(dòng)物中，沒(méi)有觀察到腎球膜的擴(kuò)張，對(duì)應(yīng)于0級(jí)(如圖5D,L,P)。移植側(cè)腎與健康側(cè)腎腎皮質(zhì)和髓質(zhì)厚度無(wú)差異，輸尿管移植后腎形態(tài)無(wú)明顯異常。在周?chē)斈蚬軇冸x時(shí)觀察到尿流出，證實(shí)尿可通過(guò)人工輸尿管結(jié)構(gòu)，無(wú)問(wèn)題。雖然所有大鼠均觀察到輸尿管蠕動(dòng)，但比正常輸尿管蠕動(dòng)弱。大鼠在第12周表現(xiàn)出最強(qiáng)的蠕動(dòng)。

僅使用支架組所有大鼠均表現(xiàn)為3-4級(jí)嚴(yán)重腎積水和輸尿管膨出。相比之下，70%的人工輸尿管結(jié)構(gòu)組表現(xiàn)為0-1級(jí)腎盂積水。人工輸尿管結(jié)構(gòu)組腎積水分級(jí)為1.00±2.66和僅使用支架組為3.33±0.33。僅使用支架組的腎積水分級(jí)明顯高于實(shí)驗(yàn)組(如圖6A)。

2. 組織病理學(xué)分析

人工輸尿管結(jié)構(gòu)與受體輸尿管融合，無(wú)任何間隙。在第2周，在人工結(jié)構(gòu)內(nèi)觀察到上皮細(xì)胞內(nèi)陷。很可能在移植時(shí)，尿液侵入了支架的插入位置，并繼續(xù)在管腔內(nèi)再生上皮細(xì)胞(如圖7A,E,I,M)。

免疫組化分析顯示，第2周大鼠人工輸尿管管腔內(nèi)有抗尿素抗體染色，輸尿管上皮未見(jiàn)完全再生(如圖7B)。然而，4周后，所有大鼠的尿路管腔都被無(wú)縫染色(如圖7F,J,N)。通過(guò)抗泛細(xì)胞角蛋白抗體染色，觀察到第2周大鼠人工輸尿管結(jié)構(gòu)的管腔內(nèi)的細(xì)胞是單層的(如圖7C)，但在第4周大鼠中形成了2-3層(如圖7G)。在第8-12周的大鼠中，厚度最終達(dá)到4-5層(如圖7K,O)。抗αSMA抗體染色顯示，人工輸尿管結(jié)構(gòu)和上皮細(xì)胞之間的肌層從正常的輸尿管側(cè)到顱側(cè)和尾側(cè)均有再生。可以觀察到，隨著周數(shù)的推移，肌肉層逐漸向內(nèi)生長(zhǎng)(如圖7D,H,L,P)。然而，再生并不是完全持續(xù)的。

在正常的上皮細(xì)胞中，CK14檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性。CK14在人工輸尿管結(jié)構(gòu)的所有時(shí)期均為陽(yáng)性(如圖8A,D,G,J)。陽(yáng)性細(xì)胞分布在人工輸尿管結(jié)構(gòu)中，隨著時(shí)間的推移其數(shù)量略有減少。血管生成標(biāo)志物VEGF在人工輸尿管結(jié)構(gòu)的所有時(shí)期均呈陽(yáng)性，陽(yáng)性細(xì)胞隨著時(shí)間的推移，分布更加密集(如圖8B,E,H,K)。Masson三色染色顯示人工輸尿管結(jié)構(gòu)中有膠原纖維。隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行這些纖維變得更致密、更厚。

人工輸尿管結(jié)構(gòu)側(cè)的平均橫截面面積為0.097±0.002 mm²，健康輸尿管側(cè)的出血面積為0.072±0.002 mm²，人工輸尿管側(cè)平均略寬于健康側(cè)。但兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（如圖6B)。

六、總結(jié)

在2-12周時(shí)，檢查大鼠身體和病理特征。在0-1級(jí)腎積水大鼠的人工輸尿管腔內(nèi)，觀察到輸尿管上皮的再生，其厚度在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中有所增加，肌肉層的再生也可以觀察到。隨著時(shí)間的推移，從正常的輸尿管側(cè)向人工輸尿管結(jié)構(gòu)延伸。然而，在12周結(jié)束時(shí)，沒(méi)有觀察到完全的再生。雖然所有病例均有輸尿管蠕動(dòng)，但比預(yù)期的要弱。因此，實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)僅完成了短段輸尿管再生。

在輸尿管再生的臨床背景下，使用人工輸尿管結(jié)構(gòu)的植入技術(shù)比傳統(tǒng)的重建方法侵入性更小，值得進(jìn)一步關(guān)注。采用膀胱壁的Boari皮瓣方法和采用回腸導(dǎo)管的尿路分流技術(shù)具有更高的侵入性，且并發(fā)癥發(fā)生率高。而人工輸尿管結(jié)構(gòu)的移植技術(shù)比傳統(tǒng)的重建技術(shù)侵入性較小。人工輸尿管結(jié)構(gòu)移植簡(jiǎn)單，不需要其他器官重建尿路。在這些方面，患者可以受益于其臨床應(yīng)用。

總之，這項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，即使是一個(gè)無(wú)支架的細(xì)胞結(jié)構(gòu)也可以用來(lái)在短距離內(nèi)再生輸尿管，幾乎沒(méi)有腎積水并保留其功能。然而，要實(shí)現(xiàn)輸尿管長(zhǎng)節(jié)段的再生和輸尿管功能的完全再生，仍有待進(jìn)一步的研究。此外，有必要在超過(guò)本研究12周的時(shí)間內(nèi)觀察人工輸尿管結(jié)構(gòu)的變化。盡管存在這些問(wèn)題，這是第一個(gè)使用活細(xì)胞結(jié)構(gòu)成功再生輸尿管的報(bào)告，使本研究可能成為未來(lái)尿路再生研究的基石。