前言

今年4月，Nature Review Drug Discovery雜志在文章“The antibody–drug conjugate landscape”中提到，抗體-藥物偶聯物（Antibody-drug conjugates, ADC）已成為腫瘤領域的一種關鍵治療方式，與多種適應癥的標準治療和化療相比，其臨床表現優越，因此預測上市和處于三期臨床開發的ADC藥物收入將在2028年達到260億美元[1]。全球癌癥發病率的上升也推動了對抗癌藥物的投資增加，促使ADC藥物市場大幅增長。盡管ADC藥物已經成功上市15個，但其仍然面臨兩大主要挑戰：首先，經驗證的有效載荷作用機制單一，限制了可治療的疾病范圍；其次，非特異性和不充分的有效載荷傳遞限制了ADC的治療窗口。本文總結了從靶點、小分子毒素和連接子這三個設計維度的創新點，并重點介紹體外ADME在研究ADC藥物中建立的各個實驗平臺及其應用。

1、ADC藥物及研發創新

ADC藥物是將單克隆抗體經過連接子與小分子毒素藥物偶聯形成的靶向藥物。ADC由三個部分組成：抗體、小分子毒素和連接子，各個組分需要具備對應的特征，抗體需要有高特異性和低免疫原性；連接子要求在循環系統中穩定，腫瘤環境中可有效釋放細胞毒素，小分子毒素則需要生理條件下穩定，且對于腫瘤細胞有很強的殺傷力；理想的ADC藥物需在血液循環中保持穩定，精準到達治療目標，并最終在目標附近釋放細胞毒性。

圖1. ADC藥物的結構[2]

1、靶點的創新

目前，從處于各個研發階段的ADC藥物可以看出，靶點主要集中在HER2、TROP2等常用靶點上?？傮w而言，約90%的靶點是在癌細胞上高表達的抗原，約10%的靶點與腫瘤微環境的獨特特征相關。新出現的靶點是一種纖維連接蛋白（FN）的額外結構域B（EDB），纖維連接蛋白是一種普遍表達的高分子量細胞外基質，其在正常組織中表達受限，在腫瘤組織中高表達。

圖2. EDB+FN蛋白在腫瘤間質與正常組織中的表達差異[3]

該靶點在腫瘤間質與正常組織中的表達差異如圖2所示。以甲狀腺和肝臟中表達為例，紫色框線是腫瘤間質的表達量，綠色是正常組織的表達量，可以看出其明顯的差異化表達。目前有一款在研的ADC藥物PYX-201靶向纖維連接蛋白，在2024年美國癌癥大會上進行了數據披露，治療效果較好[1]。

2、小分子毒素的創新

目前常用的小分子毒素作用機制是抗有絲分裂、拓撲異構酶1抑制劑和DNA烷化劑，包括熟知的MMAE（微管抑制劑）、Dxd（拓撲異構酶1抑制劑）等小分子毒素。新型的毒素是一種小分子降解劑，作用機理是選擇性降解GSPT1。GSPT1是多種腫瘤組織和細胞中顯著過表達的關鍵翻譯終止因子，小分子降解劑通過選擇性降解GSPT1進而使得細胞凋亡，其具有高特異性、皮摩爾效力和靶向多種與癌癥相關的細胞內蛋白的能力。目前在研的ADC藥物ORM-5029的有效載荷是高效選擇性GSPT1降解物。在臨床前研究的乳腺癌模型中，其抗癌活性與曲妥珠單抗（Enhertu）相似[1]。

3、連接子的創新

常用的連接子是二肽VC、四肽GGFG等，其可以通過組織蛋白酶進行裂解。新興的連接技術不依賴于內源性酶介導的切割，專注于外源性控制有效載荷的釋放。其原理是ADC與細胞外腫瘤靶點結合，然后靜脈注射外源化學探針（激活劑），選擇與ADC連接子快速反應進而釋放藥物，可以繞過對腫瘤生物學的依賴。在研的TGW101采用外源性化學激活劑來誘導有效載荷釋放，與VC二肽連接子相比，在結直腸癌和卵巢癌異種移植模型中顯示出優越的抗腫瘤活性[1]。

通過三方面的創新點可以看出，ADC還有廣闊的發展空間，在研的很多藥物以傳統經典的設計為主要導向，結合一些新的小分子毒素或者連接子等，將經典和創新相互碰撞，設計出更加合理的ADC藥物。

2、ADC藥物的體外ADME研究

根據ADC藥物在體內的代謝過程，藥明康德DMPK建立了對應的測試平臺。在靜脈注射后，首先需要保證ADC藥物在循環系統中穩定，為了評估該穩定性，可以采用血漿/全血的研究體系；到達靶組織之后，利用抗體特異性結合抗原，經過內吞作用進入腫瘤細胞，在溶酶體作用下裂解連接子，釋放細胞毒素導致細胞凋亡，為了評估細胞毒素釋放機理，建立溶酶體、組織蛋白酶B、酸化肝勻漿和肝S9等測試體系；同時可以體外評估腫瘤靶細胞中細胞毒素的釋放能力及其殺傷力。通過這些評估，可以更清楚地了解循環系統的穩定性和毒素釋放的機制，更加合理地設計ADC藥物。

1、血漿穩定性研究

選取ADC藥物DS8201開展研究，其連接子和有效載荷是GGFG和Dxd，GGFG是常用的連接子，Dxd作用機制是拓撲異構酶1抑制劑。

表1. DS8201 基本信息

通過和不同種屬的血漿及其含1%BSA的PBS孵育不同時間點直至21天，檢測血漿中Dxd的生成濃度并計算其釋放率。數據展示如下：

圖3. 不同種屬血漿和含1%BSA的PBS中Dxd的釋放濃度

表2. DS8201和血漿孵育21天后Dxd釋放濃度和釋放率

圖3呈現了DS8201在不同種屬血漿及其陰性對照組中payload釋放濃度，可以看出均有一定的釋放，但其釋放率都小于2%，說明其在循環系統中穩定，與ADC設計的想法一致，孵育21天后的Dxd釋放濃度和申報材料中的差異在3倍以內，說明血漿體系適合評估長時間的ADC的穩定性?？紤]到Dxd在不同pH下有開環閉環兩種形式，該體系將會進一步擴展優化。

2、ADC藥物在不同測試體系中payload釋放研究

維布妥昔單抗是2020年上市的一款ADC藥物，靶點為CD30, 連接子和毒素是經典的VC二肽和MMAE。

表3.維布妥昔單抗基本信息

通過和組織蛋白酶B、肝溶酶體、肝勻漿、肝S9孵育不同時間點，檢測其MMAE的生成濃度并計算其釋放率。數據展示如下：

圖4. 不同基質中MMAE的釋放濃度

圖4呈現其在不同測試體系孵育不同時間點后MMAE的釋放濃度曲線，可以看出在組織蛋白酶B和肝勻漿中，其釋放量類似，肝溶酶體和肝S9均有不同程度的釋放。所以探索ADC藥物中payload的釋放機理，根據不同連接子類型（二肽，四肽，葡萄糖苷鍵等），可以選擇不同的測試體系，以設計出更加合適的連接子。例如組織蛋白酶B是單一酶，裂解特定的連接子（VC,GGFG等），對于該類連接子可以直接用組織蛋白酶B進行研究，溶酶體則是含有多種水解酶，可以水解外源性和內源性的大分子，對于不明確裂解機理的連接子，可優先選擇該體系。

結語

機遇和挑戰并存，未來ADC藥物的發展會朝向雙靶點ADC、雙載荷ADC及其新型的連接子方向，同時隨著小分子篩選和蛋白質重組分子生物技術的進步，藥物開發中出現了新的抗體偶聯模式，包括抗體片段-細胞毒素偶聯物、抗體-寡核苷酸偶聯物（AOC）等。藥明康德DMPK已建立不同的研究平臺以評估ADC藥物在循環系統穩定性及其payload的釋放機理。面對“萬物皆可偶聯”的時代，藥明康德DMPK針對不同的偶聯技術，迎接挑戰，不斷豐富體外實驗，建立了更多的評估平臺，如組織蛋白酶L/K、葡萄糖醛酸酶等研究連接子裂解效率，更好地服務ADC藥物的研發之路。

參考文獻：

[1] Patrick Flynn, Smruthi Suryaprakash, Dan Grossman, Val Panier & John Wu, The antibody–drug conjugate landscape. Nature Review Drug Discovery, 2024.

[2] Siler Panowski, et al, Site-specific antibody drug conjugates for cancer therapy. mAbs, 2014

[3] Sharon Wilks, et al, A First-in-Human Phase 1 Clinical Study Evaluating Safety, Tolerability, Pharmacokinetics, Pharmacodynamics and Efficacy of the EDB+FN targeting ADC PYX-201 in Participants with Advanced Solid Tumors. Poster. 

[4] NDA/BLA Multi-disciplinary Review and Evaluation. Center for Drug Evaluation and Research, 2019, Enhertu.