摘 要： 建立了一種金納米粒子與花生仁膜碳量子點“關-開”型熒光探針檢測苯丙氨酸含量的方法。以花生仁膜為原料，采用水熱一步法制備花生仁膜碳量子點（CQDs），研究發現，金納米粒子能導致CQDs熒光信號的“關閉”，苯丙氨酸的加入能引起體系熒光信號重新“打開”，基于此構建了金納米粒子-CQDs“關-開”型熒光探針檢測苯丙氨酸的新方法。在pH值為9.15的BR緩沖溶液中，5～200 μmol/L范圍內的苯丙氨酸能引起CQD-Au體系熒光信號線性恢復，線性方程為ΔIF= 2.72c+ 51.275（r=0.998），檢出限為1.25 μmol/L。該方法成功應用于模擬樣品中苯丙氨酸的檢測。

關鍵詞： 花生仁膜碳量子點； “關-開”型熒光探針； 苯丙氨酸

苯丙氨酸是生物體不能靠自身自然合成的必需氨基酸之一，常作為苯丙氨芐、甲酸溶肉瘤素等氨基酸類抗癌藥物的中間體及生產腎上腺素、甲狀腺素和黑色素的原料[1]。研究表明，苯丙氨酸作為抗癌藥物的載體將藥物分子直接導入癌瘤區，既可以抑制癌瘤生長，又可以降低藥物的毒副作用，其效果是其他氨基酸的3～5倍[2]。然而苯丙氨酸的不當使用會影響使用者智力發育[3?4]，因此準確測定苯丙氨酸含量具有十分重要的意義。

測定苯丙氨酸含量的方法主要有分子印跡技術[5]、電化學分析技術[6?7]、熒光分析技術[8?9]等，這些方法測定選擇性高，靈敏度好，但也存在儀器設備相對昂貴，實驗操作相對繁瑣等弊端，因此有必要探索一種簡單、快速測定苯丙氨酸的新方法。

碳量子點（CQDs）是一種新型碳納米材料，具有性能穩定、毒性低、水溶性好、易于合成，易于功能化、具有特殊光學特性，已被廣泛應用于疾病診斷和治療[10?11]、催化降解有機污染物[12]、食品及藥物的分析檢測[13?14]等多個領域。筆者以花生仁膜為原料，通過一步水熱法成功合成了熒光強度高、發光穩定、粒徑均勻，水溶性好的CQDs，在對其發光特性表征的基礎上，發現納米金能對其熒光強度產生明顯的猝滅作用，導致量子點熒光信號“關閉”，而苯丙氨酸能重新“恢復”花生仁膜CQDs 的熒光信號，據此構建了“關-開”型熒光探針檢測苯丙氨酸的新方法。該方法具有檢出限低、選擇性較好、檢測成本低、儀器設備操作簡單、檢測過程綠色環保等諸多優點，該方法為苯丙氨酸的定量檢測提供了新思路。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

熒光光譜儀：F-7000型，株式會社日立制作所。

電熱鼓風干燥箱：101型，北京科偉永興儀器有限公司。

高速離心機：GTR16-2型，上海料科實業有限公司。

電子天平：CP124S型，感量為0.1 mg，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司。

色氨酸、酪氨酸，檸檬酸鈉：均為分析純，上海藍季科技發展有限公司。

苯丙氨酸：分析純，西安化學試劑廠。

氯金酸：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

BR緩沖溶液：向0.04 mol/L 磷酸、硼酸和乙酸混合溶液中加入0.2 mol/L NaOH溶液，調至所需pH值，即伯瑞坦-羅賓森(Britton-Robinson)緩沖溶液。

花生仁膜：市售散裝熟花生，挑選出無破損花生，去殼，小心剝離花生仁外面的紅色薄膜。

納米金(AuNPs)溶液：取適量氯金酸，用超純水稀釋并定容至1 mmol/L，加熱至沸騰，然后加入1%檸檬酸鈉溶液，充分攪拌至顏色變為酒紅色。

實驗用水：超純水。

1.2 實驗方法

1.2.1 CQDs溶液的制備

將花生仁膜反復用去離子水清洗干凈，置于表面皿中，于45℃烘干，用研缽研細，稱取2 g至100 mL反應釜中，加入60 mL超純水，于200 ℃下恒溫8 h，冷卻后加入適量超純水攪拌，調節pH至中性，過濾，濾液高速離心，取上層清液，依次用0.44、0.22 μm微孔過濾器過濾，然后轉移至100 mL容量瓶中，用高純水定容至標線，于4 ℃冰箱保存，備用。

1.2.2 苯丙氨酸檢測

移取200 μL CQDs溶液、100 μL AuNPs溶液于10 mL比色管中，加入3.00 mL pH值為9.15的BR緩沖溶液，加入適量苯丙氨酸，用高純水定容至標線，搖勻，于室溫放置3 h后，調節狹縫寬度Ex=5.0 nm，Em=5.0 nm，激發波長為320 nm，測定體系的熒光光譜，采用標準曲線法計算苯苯丙氨酸濃度。

2 結果與討論

2.1 CQDs的光學性質

2.1.1 CQDs電鏡光譜

花生仁膜碳量子點的透射電鏡圖和粒徑分布圖如圖1所示。從圖1可以看出，所合成的量子點呈較為規則的球狀，較為均勻的分布在水相體系中，粒徑主要分布在（3.5±0.5） nm區間內。

圖1   CQDs的透射電鏡圖和粒徑分布圖

Fig. 1   TEM image and the size distribution of CQDs

2.1.2 CQDs的熒光特性

考察不同激發波長下花生仁膜CQDs的熒光光譜，如圖2所示。從圖2可以看出，在220～380 nm 波長激發下，花生仁膜CQDs的熒光發射峰位置隨激發波長增加逐漸紅移，熒光強度先增加后減小，當激發波長為320 nm時，發射光譜的熒光強度達到最大。CQDs的熒光強度和發射峰位置受激發波長的影響，可能是由于CQDs納米粒子大小或CQDs表面的缺陷對電磁輻射的選擇性差異造成的。

圖2   不同激發波長下的熒光強度

Fig. 2   Fluorescence intensity at different excitation wavelengths

1→9譜線λex依次為220、240、260、280、300、320、340、360、380 nm

2.1.3 CQDs的紫外-可見光譜

取200 μL CQDs溶液于10 mL比色管中，加入pH值為7.96的BR緩沖溶液3.00 mL，用高純水定容至標線，以樣品空白為參比溶液測定紫外可見吸收光譜，如圖3所示。從圖3可以看出，花生仁膜CQDs在270 nm處有一明顯的吸收特征峰，這應該是花生仁膜CQDs碳骨架結構中共軛的碳碳雙鍵π－π*躍遷的吸收峰特征，在300～400 nm區間較為明顯的吸收可能是由C＝N、C＝O 等基團的 n→π*躍遷所引起。

圖3   CQDs的紫外-可見吸收光譜圖

Fig. 3   UV-Vis spectrum of CQDs

用花生仁膜CQDs在濾紙上涂寫成字，在365 nm紫外燈照射下能觀到明顯發光效果，如圖4所示。

圖4   紫外燈下CQD發光

Fig. 4   CQD luminescence under UV lamp

2.1.4 紅外光譜分析

用玻璃毛細管取少量制備的花生仁膜CQDs，滴涂在KBr壓片表面，測試 CQDs 紅外吸收光譜，如圖5所示。從圖5可以看出，花生仁膜CQDs分別在 3 468、1 632 cm-1 處有強吸收峰。3 468 cm-1處的伸縮振動吸收峰應該是由O—H或者N—H所引起；1 632 cm-1處的吸收峰可能是 C＝O及C＝N 官能團的存在而產生。

圖5   CQDs紅外吸收光譜圖

Fig. 5   Infrared absorption spectra of CQDs

2.2 AuNPs對CQDs的熒光光譜影響

AuNPs能對花生仁膜CQDs的熒光產生明顯的猝滅，崔雯雯等[15]已對其猝滅機理做了詳細闡述。考察了不同體積的 AuNPs溶液下花生仁膜CQDs熒光強度，如圖6所示。從圖6可以看出，AuNPs對花生仁膜CQDs的熒光產生明顯的猝滅效果，隨著 AuNPs溶液用量增加，花生仁膜CQDs熒光信號被線性猝滅，當AuNPs溶液用量達到100 μL時，花生仁膜CQDs的熒光信號已經非常微弱，此時花生仁膜CQDs的熒光信號已成功被AuNPs“關閉”，故選擇AuNPs溶液用量為100 μL。

圖6   不同體積的AuNPs下CQDs的熒關強度

Fig. 6   Fluorescence intensity of CQDS with different volumes of AuNPs

0→10 AuNPs體積依次為0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μL

2.3 三種芳香族氨基酸對AuNPs/CQDs熒光性質的影響

分別考察了色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸3種芳香族氨基酸下AuNPs/CQDs熒光強度，如圖7所示。從圖7可以看出，色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸3種芳香族氨基酸均不能直接導致花生仁膜CQDS的熒光猝滅，AuNPs的加入能成功引起花生仁膜CQDs熒光信號的“關閉”，隨后分別將3種芳香族氨基酸加入到CQDs-AuNPs體系中，只有苯丙氨酸的加入能夠導致體系的熒光信號重新得以恢復，熒光信號被重新“打開”，這可能是由于金納米粒子、苯丙氨酸、碳量子點三者之間的競爭效應導致，實驗條件下金納米粒子與苯丙氨酸的反應優先于金納米粒子與碳量子點之間的反應，苯丙氨酸進入體系能夠將與金納米粒子結合的碳量子點被釋放出來，從而原有量子點的熒光信號得以恢復，基于此構建了“關-開”型熒光探針檢測苯丙氨酸的新方法。

圖7   不同芳香族氨基酸下AuNPs/CQDs熒光強度

Fig. 7   Fluorescence intensity of AuNPs/CQDS

2—CQDs+芳香族氨基酸； 3—CQDs+AuNPs； ；4—CQDs+AuNPs+芳香族氨基酸

1—CQDs； ; under different aromatic amino acids

2.4 苯丙氨酸測定的最佳實驗條件

2.4.1 最佳pH值

考察不同pH條件下加入苯丙氨酸前后CQDs-AuNPs體系390 nm熒光強度的增加值（IF），如圖8所示。從圖8可以看出，在pH值為9.15的BR緩沖條件下加入苯丙氨酸能使CQDs-AuNPs體系的熒光信號恢復效果最佳。

圖8   不同pH下的AuNPs/CQDs熒光強度

Fig. 8   Fluoresence intensity of diffrent pH for AuNPs/CQDs

2.4.2 最佳反應時間

在pH值為9.15的BR緩沖溶液體系中，每隔1 h測定CQDs-AuNPs-苯丙氨酸體系的熒光光譜，記錄390 nm處的體系的熒光強度隨時間變化趨勢，如圖9所示。從圖9可以看出，苯丙氨酸與CQDs-AuNPs的相互反應能在1 h內快速反應完全，至少在7 h之內保持穩定，7 h后略有下降，實驗選擇反應3 h左右進行測定。

圖9   時間對測定的影響

Fig. 9   The effect of time on determination

2.5 苯丙氨酸的標準曲線

在1.2.2實驗條件下，逐步改變苯丙氨酸濃度，固定激發波長為320 nm，保持狹縫寬度為Ex=5.0 nm，Em=5.0 nm，測定熒光光譜，以苯丙氨酸濃度為橫坐標，以CQDs-AuNPs體系在390 nm處加入苯丙氨酸前后的熒光強度增加值（IF）為縱坐標繪制標準工作曲線。試驗發現，苯丙氨酸在5～200 μmol/L范圍內能引起CQD-Au體系熒光強度線性恢復，線性方程為IF=2.72C+51.275，相關系數r=0.998，由3σ/s得到方法的檢出限1.25 μmol/L，表明該方法線性關系良好、靈敏度高、選擇性好、檢出限低。

2.6 樣品測定及回收率

準確移取200 μL的CQDs溶液和100 μL的AuNPs于10 mL的比色管中，加入3.00 mL pH值為9.15的BR緩沖溶液，加入0.5 mL 1.00×10-3 mol/L苯丙氨酸，用高純水定容至10 mL標線，搖勻，制得模擬樣品溶液，按照1.2實驗方法，采用標準加入法測定苯丙氨酸并計算回收率，試驗結果見表1。

表1   回收率試驗結果

Tab. 1   Results of recovery test

3 結語

以花生仁膜為原料，采用水熱法成功制備了碳量子點，進一步研究發現金納米粒子能導致花生仁膜CQDs熒光信號的“關閉”，而苯丙氨酸的加入又能導致金納米粒子和花生仁膜CQDs體系的熒光信號被重新“打開”，依此構建了金納米粒子與花生仁膜碳量子點“關-開”型熒光探針簡單、快速檢測苯丙氨酸的光化學新方法，方法檢出限為1.25 μmol/L，模擬樣品回收率為93.5%~108.6%。該方法綠色環保、操作簡單，可為苯丙氨酸定量檢測提供新思路。

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