紫外分光光度計

紫外分光光度計是廣泛應用于生物、醫學等多個科學研究領域的儀器之一。紫外分光光度計儀器分析法是利用物質分子吸收紫外可見光譜區輻射的一種儀器分析方法。其基本原理依據朗伯·比爾定律——光被透明介質吸收的比例與入射光的強度無關，光的吸收與吸收層厚度、溶液濃度、光吸收率成正比，可用下式表示：

A=k×b×c

（A為吸光度；k為摩爾吸光系數；b為光程，即盛放溶液的液槽的透光厚度；c為溶液濃度。）

儀器結構                                        

紫外分光光度計由光源、單色器、吸收池、檢測器和信號顯示系統五大部分組成。

光源：是提供符合要求的入射光的裝置，有熱輻射光源和氣體放電光源兩類。熱輻射光源用于可見光區，一般為鎢燈和鹵鎢燈，波長范圍是350nm～1000nm；氣體放電光源用于紫外光區，一般為氫燈和氘燈，連續波長范圍是180nm～360nm。

單色器：功能是將光源產生的復合光分解為單色光和分出所需的單色光束，它是分光光度計的心臟部分。

吸收池：又稱比色皿，供盛放試液進行吸光度測量之用，其底及兩側為毛玻璃，另兩面為光學透光面，為減少光的反射損失，吸收池的光學面必須完全垂直于光束方向。根據材質可分為玻璃池和石英池兩種，前者用于可見光光區測定，后者用于紫外光區。

檢測器：是將光信號轉變為電信號的裝置，測量吸光度時，并非直接測量透過吸收池的光強度，而是將光強度轉換為電流信號進行測試，這種光電轉換器件稱為檢測器。

信號顯示系統：是將檢測器輸出的信號放大，并顯示出來的裝置。

優勢與局限性

優勢

可重復使用樣品；

可以快速進行測量；

儀器使用操作簡單；

數據分析操作簡單；

產品成本、操作成本低。

局限性

雜散光。波長選擇器并不完美，來自寬波長范圍的少量光仍可能從光源傳輸，這可能會導致嚴重的測量錯誤。

光散射。這通常是由液體樣品中的懸浮固體引起的，這可能會導致嚴重的測量誤差。比色皿或樣品中存在的氣泡會散射光，導致無法重現結果。

來自多個吸收物種的干擾。為了進行適當的定量分析，應將每種化學物質從樣品中分離出來并單獨檢查。

組件的偏差。任何儀器組件未對準定位，尤其是固定樣品的比色皿，都可能產生不可重復和不準確的結果。

操作步驟                                        

STEP 1：開機預熱

在儀器測試之前一定要進行預熱，預熱的時間應該大于20min。檢查樣品室中是否有遮光物，有則取出。

STEP 2：光源選擇

電源打開后，鎢燈會亮起。若在波長200nm～290nm之間工作，則光源切換至氘燈；在波長290nm～360nm之間工作，則要同時點亮氘燈和鎢燈。

STEP 3：波長選擇

輸入所需波長。

STEP 4：設備校準

沒有開機自動校準功能的設備需按說明書手動校準。

STEP 5：開始測量

按START鍵開始測量，通常使用裝有蒸餾水的吸收池調零后放入樣品和參比樣進行測試，并記錄測試結果。測定前要經過預實驗確定合適的樣品濃度，讓反應后的待測溶液的光吸收值位于0.3～0.7之間。否則，待測數據不能正確反映實際變化。如果不同樣品之間濃度差異較大，則在測定時應先測定低濃度樣品（淺色），再定測高濃度樣品（深色）。

STEP 6：數據處理

定量測試時通常需要先測定若干個已知濃度的待測物標準樣品，根據其吸光值與濃度繪制標準曲線。

STEP 7：關機

測量完畢后取出吸收池，清洗并晾干后入盒保存。關閉電源，拔下電源插頭，在樣品室內放入干燥劑，蓋上樣品室蓋，罩上防塵罩。

常見問題與解決措施                         

問題1：接通電源后，光源不亮

原因：①保險管燒壞；②光源燈泡損壞。

措施：①更換保險管；②檢查氘燈和鎢燈是否損壞，若損壞則及時更換燈泡。

問題2：吸光值出現負數

原因：沒做空白對照，樣品吸光值小于空白參比液。

措施：先做空白對照。

問題3：基線某段噪音很高

原因：濾光片受潮發霉，導致光能量損失嚴重。

措施：更換濾光片。

問題4：吸光值信號上下擺動

原因：開關觸點因長期氧化導致接觸不良。

措施：用金屬活化劑清洗按鍵觸點。

問題5：數字顯示不能歸零，同時圖線記錄基線位置偏高

原因：①信號處理板可能發生故障；②光電倍增管等老化，性能降低；③前置放大板出現故障，引起反饋量增大。

措施：①開機通電，先做記錄故障曲線，與原始記錄的標準曲線對照，找出異同點，并做定性定能分析。然后用一只同型號規格的新光電倍增管替換機上的光電管，再開機實驗，若結果記錄出來的圖線并沒有什么變化，則證明光電倍增管沒有老化變質。②進一步檢查信號處理板各元器件是否損壞，對影響靈敏度有關的電位器進行檢測，看數據是否正常。若都正常則說明信號處理板沒有故障。③對以上部件檢查都沒有問題，那么故障很可能發生在前置級放大板。應采用模擬測試對前置放大板進行測量，先利用直流穩壓電源，把各供電電源加上，使其電路單獨工作，把信號發生器發出的信號加到輸入端，再用示波器接在輸出端測量輸出信號。將輸入信號與輸出信號對比，若結果波形相同，說明電路沒有故障。用相同方法對另一個帶驅動器的開關管進行測量，輸入端加入信號后，示波器若沒有測出輸出端信號，則判斷開關管是損壞的，應換上同一型號規格的新開關管。

開機前將樣品室內的干燥劑取出，儀器自檢過程中禁止打開樣品室蓋。

比色皿內溶液以皿高的2/3～4/5為宜，不可過滿以防液體溢出腐蝕儀器。測定時應保持比色皿清潔，池壁上液滴應用擦鏡紙擦干，切勿用手捏透光面。測定紫外波長時，需選用石英比色皿。

測定時，禁止將試劑或液體物質放在儀器的表面上，如有溶液溢出或其它原因將樣品槽弄臟，要盡可能及時清理干凈。

實驗結束后將比色皿中的溶液倒盡，然后用蒸餾水或有機溶劑沖洗比色皿至干凈，倒立晾干。關掉電源，再將干燥劑放入樣品室內，并蓋上防塵罩，做好使用登記。

實驗小百科

紫外分光光度計的發展歷史可追溯到幾百年前。1852年，Beer參考了Bouguer在1729年和Lambert在1760年所發表的文章，提出了分光光度的基本定律，即液層厚度相等時，顏色的強度與呈色溶液的濃度成比例，從而奠定了分光光度法的理論基礎，這就是著名的朗伯·比爾定律。1854年，Duboscq和Nessler等人將朗伯·比爾定律應用于定量分析化學領域，并且設計了第一臺比色計。1918年，美國國家標準局制成了第一臺紫外分光光度計。此后，紫外分光光度計經過不斷的改進，又出現自動記錄、自動打印、數字顯示等各種新的功能。這使得分光光度法的靈敏度和準確度不斷提高，應用范圍不斷擴大。