溶出度試驗的重要性已經毋庸置疑，既能剖析口服固體制劑的不同處方工藝特點，又能體現參比制劑的內在優良品質。
溶出試驗的工作量也是任重道遠，恰逢小編實驗室有個項目正在配合藥檢所的復核，需要進行1批參比制劑和3批自制樣品的溶出曲線比較，掐指一算，20條曲線！
大家知道仿制藥的研發過程中有下面兩項工作一定會做：
首先，需要測定參比制劑的多條溶出曲線。
其次，是仿制藥研發的進程：小試 →中試 →放大批（每個步驟樣品的多條曲線應與參比制劑一致，直至放大生產到一定規模的連續三批）。
那么，溶出曲線對比過程中有哪些原則需要遵循？
小編今天簡單說一下幾個主要遵循的原則，詳細內容請參閱《普通口服固體制劑溶出曲線測定與比較指導原則》
溶出試驗方法的建立
溶出試驗方法應能客觀反映制劑特點、具有適當的靈敏度和區分力?？蓞⒖加嘘P藥典標準或文獻。
但在我們所能獲取的各國藥典質量標準或是很多原研企業公開的標準中，很多品種的溶出度試驗均具有一定的“隱晦性”，這是因為當產品成型以后，有區分力的溶出方法就不需要了。
所以藥典標準只能作為參考。
要設計有區分力的溶出方法，需要秉承“質量源于設計”的理念。我們要掌握藥物的溶解性、滲透性、pKa常數等理化性質，并對參比制劑進行深度剖析和解讀，考察溶出裝置、介質、攪拌速率和取樣間隔期等試驗條件，確定適宜的試驗方法。
參比制劑批號的遴選
原則上需購買不同時間點的不同批號（至少3批），分別在各pH值溶出介質中測定，觀測溶出曲線波動情況。
在曲線比對時，要求自制樣品的含量與參比制劑的差值應在5%以內，每個品種各取12個單位，但在小試階段或是預實驗時可以測定6個單位，甚至更少。
在進行仿制藥研發時，考慮到原研產品的批間差異與耐受性，建議最好從市場流通渠道獲得有效期內不同時間段的3~5批樣品，分別測定后，取結果均值用于比較。如果主成分是在溶解狀態下進行溶出度試驗的（如一些散劑、顆粒劑），則適當選擇某一批號即可。
溶出介質的選擇
溶出介質的研究應根據藥物的性質，充分考慮藥物在體內的環境，選擇多種溶出介質進行，必要時可考慮加入適量的表面活性劑、酶等添加物。
在確定藥物主成分穩定性滿足測定方法要求的前提下，推薦選擇不少于3種pH值的溶出介質進行曲線考察。
常用介質pH值為1.0、4.5、6.8和水。
根據藥物性質也可進行變動。一般情況下，不同介質的pH選擇原則如下：
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制劑類型 |
介質pH值選擇 |
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普通酸性制劑 |
pH值分別為1.2、5.5~6.8、6.8~7.5和水 |
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普通中/堿性制劑和包衣制劑 |
pH值分別為1.2、3.0~5.0、6.8和水 |
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腸溶制劑 |
pH值分別為1.2、6.0、6.8和水 |
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緩控釋制劑 |
pH值分別為1.2、3.0~5.0、6.8~7.5和水 |
水可作為溶出介質，但使用時應考察其pH值和表面張力等因素對藥物及輔料的影響。
1、部分緩釋制劑需研究酒精引起的突釋
如鹽酸二甲雙胍緩釋片、阿片類藥物的緩釋制劑。酒精不應該引起藥物的突釋，如果有，應與參比制劑一致。
此時需要驗證的介質還有：
0.1mol/L鹽酸+0%乙醇；
0.1mol/L鹽酸+5%乙醇（啤酒）；
0.1mol/L鹽酸+20%乙醇（混合）；
0.1mol/L鹽酸+40%乙醇（白酒）。
同樣需要12個單位，介質體積為900ml，每隔15分鐘取樣，至2h結束。
2、pH依賴性制劑
對于pH依賴性制劑，應對溶解度急劇變化的pH值范圍予以細分（±0.5，甚至±0.1），找到45~60min達85%的pH值介質和90~120min達85%的pH值介質，且溶出曲線應無拐點和突釋。
推薦使用的各種pH值溶出介質的制備方法見《普通口服固體制劑溶出曲線測定與比較指導原則》。
這里需要強調一下，pH1.0鹽酸介質理論上是量取9ml濃鹽酸→1000ml水中（USP中pH1.0鹽酸介質理論上是量取8.5ml濃鹽酸→1000ml水中），pH1.2鹽酸介質理論上是量取7ml濃鹽酸→1000ml水中，兩種溶液中濃鹽酸的體積不同。
并且在首次配制鹽酸介質時需要測定pH，記錄所用濃鹽酸的真實體積，按照理論值量取的介質pH值一般比真實值更高。
測定與結束時間選擇
1、測定時間點
普通制劑和腸溶制劑可為5、10、15、20、30、45、60、90、120分鐘，此后每隔1小時進行測定。
緩控釋制劑可為15、30、45、60、90、120分鐘、3、4、5、6、8、10、12、24小時。
2、結束時間點
（1）連續兩點溶出量均達85%以上，且差值在5%以內。一般在酸性溶出介質（pH1.0~3.0）中考察時間不超過2小時。
（2）在其他各pH值介質中普通制劑不超過6小時。
（3）緩控釋制劑一般設定50rpm、并以每天服用次數設定取樣時間點，如該制劑每天需服用1次，溶出曲線應測定至24h，并在該時間內曲線應呈緩慢上升狀，且無突釋和拐點。
溶出條件的優化
在截止時間內，如果藥物在所有溶出介質中平均溶出量均達不到85%時，可優化溶出條件，直至出現一種溶出介質達到85%以上。優化的手段包括提高轉速、加入適量的表面活性劑，酶等添加物。
表面活性劑常用十二烷基硫酸鈉和吐溫-80。表面活性劑濃度以0.01%（w/v）為起點，按照1、2、5級別逐步增加，不建議采用3.0%以上濃度。
還有一點需要強調，針對某個釋放慢的溶出介質，大家觀點有爭議：
一部分人認為，此時無需放寬試驗參數，最終溶出量未達85%仍可進行自制樣品與參比制劑的曲線比較，因已有三條曲線達85%、且其中還含有區分力介質，故該介質無需再深入研究；還有的同仁覺得，應該加入表面活性劑或提高轉速使溶出量達到85%，再進行相似因子比較。
小編認為，具體情況具體分析吧，沒有一定的標準，只能Case by Case 。
對于難溶性口服固體制劑，如在50rpm條件下任何一個介質在120min內的溶出量均達不到85%，則建議放寬溶出度試驗參數，仍是應盡可能采用低轉速和低濃度表面活性劑，仍是以45~120min達到85%的條件確定為準。
提到轉速，小編想起有次參加培訓，有個廠家代表提出這樣一個問題：
該廠家作為某一制劑的首仿，BE試驗證實兩者等效，但是在50rpm條件下，各溶出介質都無法體外相似，而CDE要求補充體外溶出一致的數據，最后一位國內大咖給的意見就是將轉速由50rpm提高到65rpm。有類似情況的同仁們可以進行借鑒。
溶出曲線的比對
自美國和日本等國的官方機構認定采用模型非依賴方法之一的“相似因子比較法”之后，現基本上被統一采納。該法特點是對溶出曲線進行整體評價，通過計算相似因子（f2）比較溶出行為的相似性。
1、f2因子計算方法
最基本的條件：參比和自制樣品必須采用同劑型、同規格的制劑。應確保在完全相同的條件下對受試樣品和參比樣品的溶出曲線進行測定。
Rt為t時間參比樣品平均溶出量；
Tt為t時間受試樣品平均溶出量；
n為取樣時間點的個數。
f2因子的計算，時間點的選取應盡量遵循溶出量等分原則：
如最終溶出量為90%，四等分即在制劑的溶出曲線上尋找22.5%、45%、67.5%的最相近的溶出時間點；三等分即在制劑的溶出曲線上尋找30%、60%的最相近的溶出時間點。
計算時兩制劑所取時間點必須一致；且計算時間點應不少于3個，普通速釋制劑選取3~4個、緩控釋制劑選取3~5個，不超過7個；溶出率85%（緩控釋制劑80%以上）以上的時間點應不多于1個。
建議研究者可依據參比制劑溶出率的具體情況，以溶出量盡可能等分為原則進行選擇。
第一個時間點融出結果的RSD不得過20%，自第2個時間點至最后時間點融出結果的RSD不得過10%。如果不符合，應從儀器適用性予以考慮解決，可以增加轉速。但對于本身變異性較大的品種，n應增至12~18。
對于自研樣品，如各時間點RSD仍超出規定，說明制劑處方工藝仍需優化。
2、判定標準
采用相似因子（f2）法比較溶出曲線相似性時，一般情況下，當兩條溶出曲線相似因子（f2）數值在50~100之間時，可認為溶出曲線相似。
當受試樣品和參比制劑在15分鐘的平均溶出量均不低于85%時，可認為溶出曲線相似。
需要注意的是，在f2大于50中的藥物中存在生物不等效的比例是60.6%，而在生物等效的藥物中f2小于50的比例是40.9%，也就是“假陽性”和“假陰性”的存在。體外溶出試驗只能模擬藥物的釋放和溶出速率，只有當這兩個過程是藥物吸收的限速步驟時，IVIVC才可以建立。
所以溶出曲線的相似并不意味著兩者一定生物等效，但該法可降低兩者出現臨床療效差異的風險。
如何高效測定溶出度樣品
就如文章開頭所說，溶出曲線在現在我們進行的試驗中占很大一部分比重，所以高效地測定溶出曲線對于我們現在的工作非常重要。
想要提高效率，除了將指導原則爛熟于胸，深刻理解，還有一些小竅門。
小編總結了一下自己的小竅門，分享給大家。
1.盡量采用HPLC法
因HPLC法的線性范圍較寬，從第一個取樣點到最后一個取樣點的樣品都可以直接進行測定，尤其對于緩控釋制劑取樣時間較長，取樣點較多，用HPLC法測定可以編輯程序夜間進樣，大大提高效率。而采用UV法時，最佳紫外吸收范圍是0.2~0.8，有些取樣點的樣品需要進行稀釋才可進行測定，工作比較繁瑣。
2.主成分出峰時間控制在5分鐘之內
將色譜柱換為短色譜柱或是在不影響雜質與主峰分離度的前提下提高流動相中有機相的比例，將主成分出峰時間控制在5分鐘之內。
3.在柱壓承受范圍內適當提高流速
4.合理安排工作時間與取樣點之間的關系
比如緩控釋制劑完全可以在工作時間內將前面密集取樣點完成。
5.可將各取樣點溶出液直接置于液相進樣瓶，無需先置于試管再進行轉移
否則不但繁瑣，事后還要清洗試管，增加了工作量。
大家有不同看法可以在下方留言區進行探討，歡迎大家留言分享自己的小竅門。
