摘要

目的：分析與評價尼可地爾片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可行性及質(zhì)量狀況。

方法：采用法定檢驗標(biāo)準(zhǔn)對88批尼可地爾片進行檢驗和統(tǒng)計分析，并采用探索性研究的方式對國內(nèi)企業(yè)生產(chǎn)的尼可地爾片的有關(guān)物質(zhì)、溶出曲線、含量均勻度和含量測定等項目進行了考察與評價。

結(jié)果：按法定檢驗標(biāo)準(zhǔn)檢驗了共88批尼可地爾片樣品，合格率100%。通過探索性研究發(fā)現(xiàn)相關(guān)法定檢驗標(biāo)準(zhǔn)項目設(shè)置不完善，部分方法專屬性較差，存在不能準(zhǔn)確測定真實含量的問題；部分輔料、生產(chǎn)工藝及包裝易導(dǎo)致樣品水分增加，影響穩(wěn)定性。

結(jié)論：收集到的尼可地爾片與原研制劑存在差距，建議相關(guān)企業(yè)選擇適宜的輔料加強原輔料的水分控制及工藝過程中水分、溫度等參數(shù)控制并改進包裝，以降低雜質(zhì)產(chǎn)生量；采用區(qū)分度高的溶出度控制方法進行質(zhì)量控制，進行仿制藥質(zhì)量與療效一致性評價，提高產(chǎn)品質(zhì)量。目前相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)存在缺陷，建議針對鑒別、有關(guān)物質(zhì)、溶出度、含量均勻度和含量測定項目進行完善。

關(guān)鍵詞

尼可地爾片；質(zhì)量分析；藥品監(jiān)管；仿制藥一致性評價

尼可地爾（Nicorandil），化學(xué)名為N-（2-羥乙基）煙酰胺硝酸酯，屬硝酸酯類化合物，是一種ATP敏感性鉀通道開放劑，一般由N-（2-羥乙基）煙酰胺經(jīng)硝酸酯化得到，或由氨基乙醇硝酸酯，再經(jīng)酰化反應(yīng)生成。該品種由日本中外制藥株式會社于1978年首先試制成功，臨床上主要用于治療冠心病，心絞痛[1-6]。尼可地爾的國產(chǎn)仿制藥最早由江蘇省徐州醫(yī)藥科學(xué)研究所與豐縣制藥廠協(xié)作研制，1986年1月由江蘇省衛(wèi)生廳批準(zhǔn)豐縣制藥廠生產(chǎn)原料和片劑并上市[7]。為更好評價市售尼可地爾片的質(zhì)量，并對相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和影響藥品質(zhì)量的關(guān)鍵參數(shù)進行分析，本次研究依據(jù)保證藥品安全性和有效性的原則對市售的尼可地爾片開展按法定標(biāo)準(zhǔn)檢驗和探索性研究，對質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項目設(shè)置的全面性、合理性以及制劑中的有關(guān)物質(zhì)來源、影響因素，溶出曲線情況和樣品含量等進行考察，根據(jù)研究結(jié)果對該品種相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)存在的問題和品種質(zhì)量情況進行了深入的分析，并提出相關(guān)評價和建議，以期為藥品監(jiān)管部門和相關(guān)生產(chǎn)企業(yè)提供參考。

1儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20A高效液相色譜儀（日本島津公司），1200高效液相色譜儀（美國Agilent公司），2690高效液相色譜儀（美國Waters公司），SOTAX自動溶出儀（瑞士SOTAX公司），RCZ-8M自動溶出儀（天津天大天發(fā)科技有限公司），ZB-1E智能崩解儀（天津天大天發(fā)科技有限公司），TU-1901紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司），QE高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀（美國Thermo公司），AVANCEⅢ400兆核磁共振譜儀（德國Bruker公司），µDissTM型光纖藥物溶解性測定儀和µFluxTM型光纖藥物滲透性測定儀（美國Pion公司），UltimaⅣ型粉末X射線衍射儀（日本Rigaku公司），Mastersizer2000激光衍射粒度分布儀（英國Malvern公司），Titrando890水分測定儀（瑞士Metrohm公司），KB240恒溫恒濕箱（德國Binder公司），XA205電子天平（美國Mettler Toledo公司）。三氟乙酸、三乙胺、四氫呋喃等流動相用試劑均為色譜純，水為純化水。尼可地爾對照品由中國食品藥品檢定研究院提供，尼可地爾片樣品均來源于國家藥品計劃抽驗。

1.2 樣品

通過查詢國家藥品監(jiān)督管理局網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫，尼可地爾片國內(nèi)共有56家生產(chǎn)企業(yè)56個批準(zhǔn)文號，但僅有部分企業(yè)實際生產(chǎn)。本次研究共獲得兩家生產(chǎn)企業(yè)共88批樣品，經(jīng)調(diào)研，A企業(yè)采用濕法制粒壓片法，B企業(yè)和原研企業(yè)均采用粉末直接壓片法進行生產(chǎn)。獲得的88批樣品覆蓋我國18個省、自治區(qū)、直轄市，樣品來源涉及生產(chǎn)企業(yè)、經(jīng)營企業(yè)和醫(yī)療機構(gòu)，其中生產(chǎn)企業(yè)1批（1.1%）；醫(yī)療機構(gòu)21批（23.9%）；經(jīng)營企業(yè)66批（75.0%）。樣品覆蓋地域范圍大，來源分布廣泛，涉及全國范圍內(nèi)藥品生產(chǎn)、經(jīng)營和使用的各個環(huán)節(jié)，具有評價意義。

相關(guān)產(chǎn)品的藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為WS-10001-（HD0151）-2002[8]，英國藥典亦有收載[9]。

2檢驗結(jié)果及質(zhì)量分析

對獲得的88批尼可地爾片樣品按國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS-10001-（HD-0151）-2002（以下簡稱國家藥品標(biāo)準(zhǔn)）檢驗，檢驗項目包括性狀、2項化學(xué)反應(yīng)鑒別、溶出度、含量均勻度和含量測定，結(jié)果均符合規(guī)定，合格率為100%。A企業(yè)樣品測定結(jié)果顯示，不同地域同批號樣品測定結(jié)果間有差異，B企業(yè)不同地域同批號樣品測定結(jié)果間無明顯差異，故地域因素會影響A企業(yè)藥品質(zhì)量，但未影響B(tài)企業(yè)藥品質(zhì)量。

2.1 鑒別

國家藥品標(biāo)準(zhǔn)鑒別方法為取本品細粉適量（約相當(dāng)于尼可地爾0.15g），加丙酮10mL，振搖使溶解，濾過，濾液置水浴上蒸干，取殘渣照下述方法試驗。化學(xué)鑒別（1）：取殘渣約0.1g，加水與氫氧化鈉試液各5mL，溶解后，緩緩煮沸，即產(chǎn)生刺激性氣味，繼續(xù)加熱至氣味完全除去，加酚酞指示液1~2滴，用稀硫酸中和后，加硫酸銅試液2mL，緩緩析出淡藍色沉淀，濾過，取沉淀灼燒，即產(chǎn)生吡啶臭氣。經(jīng)檢驗所有批次樣品均呈正反應(yīng)，合格率100%。化學(xué)鑒別（2）：取殘渣約10mg，置試管中，加水1mL與硫酸2mL，振搖使溶解，放冷，沿管壁緩緩加硫酸亞鐵試液3mL，兩液層接界面顯棕色。經(jīng)檢驗所有批次樣品均呈正反應(yīng)，合格率100%。

2.2 溶出度

國家藥品標(biāo)準(zhǔn)中溶出度采用小杯法，鹽酸（稀鹽酸24→1000）溶液250mL為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速50rpm，30min取樣，在261nm下用紫外E值法測定，限度為70%，經(jīng)測定，88批樣品均符合規(guī)定，合格率100%。A企業(yè)49批樣品的溶出度均值最小值為86%，最大值為108%，平均值為100%。B企業(yè)39批樣品的溶出度均值最小值為94%，最大值為106%，平均值為100%。結(jié)果表明，不同生產(chǎn)企業(yè)樣品的平均溶出量中位值均在100%附近，但平均溶出量結(jié)果差異較大，結(jié)果分布較為分散。其中A企業(yè)樣品最低與最高溶出度均值相差22%，最低與最高批內(nèi)RSD相差10.15%，B企業(yè)樣品最低與最高溶出度均值相差12%，最低與最高批內(nèi)RSD相差7.26%，兩家企業(yè)樣品批間與批內(nèi)溶出度差異均較大，其中A企業(yè)樣品批間與批內(nèi)溶出度差異相對更大。溶出度結(jié)果顯示，雖然兩家企業(yè)的樣品均合格，但結(jié)果離散性均較大。

2.3 含量均勻度

與溶出度相似，國家藥品標(biāo)準(zhǔn)中含量均勻度檢查也為在261nm下用紫外E值法測定，限度為A+2.2S≤15.0。測定結(jié)果顯示，兩家企業(yè)A+2.2S平均結(jié)果差異不大。但比較不同企業(yè)樣品的含量均勻度A值與S值，可以看出A企業(yè)各批樣品間S值差異相對較小且集中，說明工藝相對穩(wěn)定，但A值差異較大，顯示其樣品批間差異相對較大，說明投放原料不穩(wěn)定或樣品發(fā)生不同程度的降解；而B企業(yè)各批樣品間的S值差異相對較大，顯示其樣品批內(nèi)差異較大，說明其壓片等工藝的穩(wěn)定性有待提高，而A值差異相對較小，說明其質(zhì)控相對穩(wěn)定。綜上所述，88批樣品含量均勻度雖都合格，但A企業(yè)樣品批間差異較大，而B企業(yè)批內(nèi)差異較大，因此兩家企業(yè)有必要加強生產(chǎn)工藝，使樣品均一性更好。

2.4 含量測定

對獲得的共88批次尼可地爾片按國家藥品標(biāo)準(zhǔn)進行測定，檢驗結(jié)果均在限度90.0%~110.0%，均符合規(guī)定，合格率100%。結(jié)果顯示，A企業(yè)樣品含量測定均值略高于B企業(yè)樣品，不同生產(chǎn)企業(yè)樣品的含量測定結(jié)果差異較小，結(jié)果分布較集中。另外在對A企業(yè)同批號不同地域樣品的檢測中發(fā)現(xiàn)，其中41.3%的樣品含量測定結(jié)果超出104%的情況，且同批不同地域樣品含量測定差異極值大于6%。分析導(dǎo)致該結(jié)果的原因可能有三方面：①企業(yè)超100%投料；②樣品含量測定專屬性不佳，降解產(chǎn)物的紫外吸收大于主成分，干擾了測定結(jié)果；③包裝隔離不足，導(dǎo)致環(huán)境濕度等條件對樣品主成分產(chǎn)生了影響。綜上，兩家企業(yè)樣品含量均值均高于100%，但同批號樣品含量差異大，提示可能與企業(yè)制備工藝、包裝以及儲藏有關(guān)。

2.5 現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)存在的問題

通過評估，現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)不能全面分析國內(nèi)尼可地爾片的產(chǎn)品質(zhì)量，其主要問題有：①項目設(shè)置不完善，無有關(guān)物質(zhì)檢查項，缺乏對藥品安全性進行有效控制的手段。②尼可地爾片鑒別項中有通過聞氮氧化物及吡啶的方式進行鑒別的步驟，對檢驗員身體健康有影響，且缺乏專屬性較高的鑒別項目。③現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)含量均勻度、含量測定均采用紫外E值法測定含量，專屬性差，不能準(zhǔn)確測定其真實含量。④現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)方法采用小杯法，使用鹽酸溶液作為溶出介質(zhì)，30min取樣，限度為70%，與原研制劑采用的大杯法有差異，不利于仿制藥一致性評價工作的進行，且檢測方法為紫外E值法，專屬性差，不能準(zhǔn)確測定溶出液中的主成分含量。

3探索性研究結(jié)果及質(zhì)量分析

根據(jù)國家藥品標(biāo)準(zhǔn)檢驗中發(fā)現(xiàn)的問題，圍繞樣品的安全性和有效性進行了探索性研究。

3.1 有關(guān)物質(zhì)

因現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)未收載有關(guān)物質(zhì)檢查項，且其含量測定等方法均為紫外E值法，專屬性較差，因此對尼可地爾片的有關(guān)物質(zhì)情況了解不深入。目前英國藥典雖有收載采用高效液相色譜法（HPLC）的尼可地爾片有關(guān)物質(zhì)檢查項，2017年版本對方法進行了變更，但是其新舊方法均無法有效分離國內(nèi)尼可地爾片的有關(guān)物質(zhì)[10-12]。因此，本研究團隊首先建立了一個能夠?qū)鴥?nèi)尼可地爾片樣品進行有效分離的高效液相色譜有關(guān)物質(zhì)檢查方法對樣品的有關(guān)物質(zhì)進行測定[13]。采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）、核磁共振等技術(shù)對樣品中存在的雜質(zhì)進行考察，明確雜質(zhì)結(jié)構(gòu)。通過ADMET Predictor軟件預(yù)測毒性和細胞毒性試驗考察雜質(zhì)毒性，結(jié)果顯示雜質(zhì)毒性均較小，且均低于主成分尼可地爾。用建立的高效液相色譜有關(guān)物質(zhì)檢查方法對88批樣品進行了檢驗，樣品雜質(zhì)含量較高，平均雜質(zhì)總量為9.9%（圖1）。其中A企業(yè)樣品的雜質(zhì)總量和各單個雜質(zhì)量與離散值顯著高于B企業(yè)樣品，反映出樣品相對質(zhì)量較差。通過對原料藥及原研制劑的測定，發(fā)現(xiàn)各企業(yè)的原料藥雜質(zhì)量均較低（雜質(zhì)總量不超過0.1%）且原研制劑的雜質(zhì)總量明顯低于國內(nèi)企業(yè)。由結(jié)果可得：①采用粉末直接壓片樣品（原研和B企業(yè)）的有關(guān)物質(zhì)明顯少于濕法制粒壓片樣品（A企業(yè)），說明水分控制是影響有關(guān)物質(zhì)產(chǎn)生的關(guān)鍵因素。②同樣采用粉末直接壓片工藝生產(chǎn)的樣品（原研與B企業(yè)），其有關(guān)物質(zhì)的量差異依然很大，說明輔料及相關(guān)工藝也是影響產(chǎn)品穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素。③制劑中的雜質(zhì)含量比原料藥中明顯增大，說明主成分易受處方、制劑工藝、儲藏條件的影響。

圍繞以上問題開展了5個方面的延伸性探索性研究。①在對A企業(yè)采用的濕法制粒壓片生產(chǎn)工藝研究中發(fā)現(xiàn)，樣品在制粒到壓片的過程中，每個步驟中雜質(zhì)都有所增長，尤其是在制粒過程，雜質(zhì)總量增長較快（3.1%），推測制粒中的濕熱條件是導(dǎo)致雜質(zhì)顯著增加的關(guān)鍵因素，該推論在后續(xù)進行的探索性研究中得到了確證。此外，壓片后片劑的雜質(zhì)總量為3.8%，而獲得的A企業(yè)共49批次樣品有關(guān)物質(zhì)雜質(zhì)總量的均值明顯更高，說明更多的雜質(zhì)是在長期儲藏過程中產(chǎn)生的。②在穩(wěn)定性影響因素研究中發(fā)現(xiàn)在高溫條件下原料藥和制劑雜質(zhì)都隨時間延長顯著增加，說明尼可地爾不能耐受高溫。據(jù)調(diào)研，尼可地爾在40~70℃時會發(fā)生聚合反應(yīng)不斷生成多聚體[14]，使雜質(zhì)量不斷增加。高濕條件下，各廠家原料藥的雜質(zhì)均有增加，而制劑吸濕明顯，雜質(zhì)增加量明顯高于原料藥，表明尼可地爾片對濕度較為敏感，其制劑存在原輔料相容性問題。在強光照射條件下，原料的雜質(zhì)量有所增加，制劑相對于原料藥更加穩(wěn)定，可能因尼可地爾被輔料包裹，較少被光照直射有關(guān)。③通過對原研和國內(nèi)企業(yè)樣品的水分進行測定，結(jié)果顯示，A企業(yè)的樣品水分（均值7.9%）明顯高于B企業(yè)（均值5.4%），而原研藥水分均值僅為0.6%。通過相關(guān)性分析，樣品的水分值與所有雜質(zhì)的生成顯著正相關(guān)（P<0.01），與影響因素試驗高濕試驗結(jié)果吻合，說明水分嚴(yán)重影響尼可地爾的穩(wěn)定性。④在原輔料相容性研究中發(fā)現(xiàn)，引濕性較強的輔料如羧甲基淀粉鈉、糊精等，均會導(dǎo)致雜質(zhì)顯著增加，說明該類型輔料存在著原輔料相容性問題，應(yīng)盡量避免使用。⑤在包裝影響研究中發(fā)現(xiàn)，在同樣溫度條件下，處于加干燥劑的包裝內(nèi)的樣品雜質(zhì)增加相比裸片更緩慢，說明高濕度環(huán)境會加快尼可地爾的降解速度。在長期的放置中鋁塑板內(nèi)的片劑的雜質(zhì)量會與裸片趨于等同，單純的鋁塑板不能有效起到保護制劑的作用，相比之下雙鋁箔板隔絕效果更佳。此外，雖然同樣采用了鋁塑板（或雙鋁箔板）加鋁箔袋內(nèi)附干燥劑的包裝形式，但原研制劑的雜質(zhì)量可維持在相對較低的水平，而B企業(yè)樣品的雜質(zhì)量逐漸上升。提示兩個企業(yè)的制劑可能存在著干燥劑效能方面的差異。通過干燥劑效能試驗，結(jié)果表明，原研藥所用的干燥劑吸濕性能為B企業(yè)的10倍以上，可以更有效地控制鋁箔袋中濕度。

3.2 溶出度

口服制劑在人體中的生物利用度是評價藥物有效性的重要指標(biāo)，其中溶出度作為體外手段體現(xiàn)口服制劑的生物有效性，可通過考察不同pH值溶出介質(zhì)中的溶出曲線來評價制劑的生物有效性[15，16]。參照日本橙皮書條件[17]，按照溶出度與釋放度測定法（《中國藥典》2020年版通則0931第二法）[18]，分別以水、pH1.2、pH4.0、pH6.8緩沖溶液900mL為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速50rpm，經(jīng)2、4、6、10、15、20、30、45、60min時，取溶液5mL，濾過，取續(xù)濾液用探索性研究建立的含量測定HPLC色譜條件進行溶出曲線研究。如圖2所示，原研制劑在4種溶出介質(zhì)中的溶出速率較快，在4種介質(zhì)2min時的平均溶出量已達40%，B企業(yè)溶出行為與原研制劑較為相似，而A企業(yè)的制劑在4種溶出介質(zhì)中15min前的溶出速率明顯慢于其他兩家企業(yè)的制劑。為考察溶出曲線差異是否由于原料藥性質(zhì)不同導(dǎo)致，本研究對各企業(yè)原料藥的溶解度，固有溶出速率，被動轉(zhuǎn)運的有效滲透性，LogP、LogD值、晶型、粒度等性質(zhì)進行了測定與考察。結(jié)果顯示，原料藥不是造成溶出曲線差異的關(guān)鍵因素。通過崩解時限的考察，A企業(yè)樣品崩解時限（5.6min）要遠遠高過原研制劑（0.9min）。推測A企業(yè)溶出速率慢于其他兩家企業(yè)樣品的原因為其采用濕法制粒引入較強粘合劑，造成片劑崩解較慢，考慮到藥品的抗心絞痛功效，提示企業(yè)應(yīng)調(diào)整工藝，提高藥品的溶出速率。參照日本“橙皮書”條件，建立了溶出度HPLC檢查方法，并用該方法測定了獲得的88批次樣品，結(jié)果顯示兩家企業(yè)樣品溶出度均值分布較為分散，且溶出度結(jié)果相較國家藥品標(biāo)準(zhǔn)測定結(jié)果均有不同程度降低，經(jīng)與探索性研究建立的HPLC方法含量測定檢測結(jié)果比對，溶出度低的主要原因為該批次樣品含量偏低。

3.3 含量均勻度

取本品1片，置50mL量瓶中，加流動相適量，超聲并振搖使尼可地爾溶解，用流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液，并用流動相配制相同濃度的對照品溶液，按建立的HPLC色譜條件（同“4.4含量測定”）檢驗88批樣品。比較不同企業(yè)產(chǎn)品的含量均勻度A值與S值，與按現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)檢驗結(jié)果不盡相同，A企業(yè)各批樣品間的A值和S值均較大，顯示其樣品批間和批內(nèi)差異均較大。而B企業(yè)各批樣品間S值差異相對較大，A值差異相對較小，顯示其樣品批內(nèi)差異較大。兩企業(yè)樣品均存在一定的工藝問題，建議相關(guān)企業(yè)加強生產(chǎn)工藝的研究，提高產(chǎn)品均一性。

4.4 含量測定

由于降解產(chǎn)物與主成分紫外最大吸收波長相近，故采用紫外E值法測定專屬性較差。故建立HPLC方法，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（Inertsil ODS-3V C18，4.6×150mm，5µm），以甲醇-水（30∶70）為流動相，流速1.0mL·min-1，柱溫30℃，以262nm作為檢測波長，進樣體積為20µL。精密稱取約相當(dāng)于尼可地爾10mg的樣品，置100mL量瓶中，加流動相適量，超聲并振搖使尼可地爾溶解，用流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液，并用流動相配制相同濃度的對照品溶液，共檢驗88批樣品。兩家企業(yè)樣品測得的含量相較于紫外E值法測定的含量均有所降低，其中A企業(yè)降低更多，根據(jù)有關(guān)物質(zhì)研究結(jié)果，這主要是由于A企業(yè)采用濕法制粒壓片，制劑本身水分較高，同時其包裝不足以隔離外部溫濕度環(huán)境對樣品的影響，使樣品發(fā)生降解，進而導(dǎo)致了上述結(jié)果的產(chǎn)生。

4建議

通過研究發(fā)現(xiàn)尼可地爾片目前的相關(guān)藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及樣品的處方、生產(chǎn)工藝和包裝方面都存在若干問題。在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方面本研究建議：①增訂有關(guān)物質(zhì)檢查方法，制定合理的雜質(zhì)限度；②修訂含量測定和含量均勻度檢查方法，將紫外E值法修訂為專屬性強的液相色譜法；③將溶出度檢查方法由小杯法（《中國藥典》2020年版附錄0931第三法）-紫外E值法修訂為槳法（《中國藥典》2020年版附錄0931第二法）-液相色譜法；④修訂對檢驗員健康有風(fēng)險的鑒別項，建立專屬性強的液相色譜鑒別方法。在處方和生產(chǎn)工藝方面建議該品種仿制藥生產(chǎn)企業(yè)按原研藥調(diào)整處方，采用區(qū)分度高的溶出度控制方法進行質(zhì)量控制，進行仿制藥質(zhì)量與療效一致性評價。同時在處方中盡可能減少或避免使用羧甲基淀粉鈉等具有引濕性的輔料，并盡量采用非濕法制粒工藝生產(chǎn)該品種，同時加強原輔料的水分控制及工藝過程中水分、溫度等參數(shù)控制，以降低雜質(zhì)產(chǎn)生量。在包裝方面建議企業(yè)使用雙鋁箔板與自封式鋁箔袋的包裝，于鋁箔袋中加入高效能干燥劑并在說明書及外包裝中增加提醒患者在開封后保留干燥劑的說明。