歐洲藥典委員會在第152次會議上（2015.06）批準了新版技術專論的技術指南（第7版）的發行，在EDQM網站可查。在本文件中，在響應和校正因子部分進行了完善，提供了關于如何確定這些因子的詳細說明。

第7版技術指南中相關章節是以下文章的摘錄，其中提供了關于響應和校正因子定義以及測定二者的詳細信息，并展示了分析人員可能面臨的挑戰以及如何克服這些挑戰的示例。

介紹

歐洲藥典的大多數專論都采用液相色譜法紫外檢測器進行有關物質的測定[1]。這些試驗用于測定產物或合成副產物或降解物等雜質。

最近的專論區分了特定雜質和非特定雜質[2]，特定雜質存在單獨的接受標準，因此有必要在色譜系統中準確的鑒定它們。這里的鑒定，不要和闡明結構的鑒別，意義弄混淆，更好的表述應該是“峰鑒別”。后者最好使用化學標準物質（CRS）進行，由于不能獲得足夠量的單個雜質，亦可使用該專論物質（即待測物，以下稱為供試品）和特定雜質的混合物或者是沒有加入供試品的雜質混合物進行[3]。

專論中不僅提供了在色譜系統中鑒別這些雜質的方法，同時描述了如何對其定量。

定量

樣品中雜質的量通常使用“外標法”測定，但也采用面積歸一化法。

當使用外標法時，優先的選擇是使用單個雜質來制備含有這些雜質的標準溶液，標準溶液的濃度應在特定雜質的限度范圍內，即相對于供試液的濃度0.1~1.0%之間。

然而，如上所述，這些雜質通常不能獲得足夠量作為單獨的對照品并建立標準。這種情況下，可以將供試液的稀釋液，例如1/100供試液，作為測定樣品中這些雜質量的對照。當供試品與雜質具有相似的吸收曲線時，即在選定的波長下檢測器的響應是相似的，可以選擇此法。另一方面，不同的吸收曲線可能會導致在所選波長處響應值有明顯的不同。因此，在方法學驗證中，測定特定雜質的響應因子的必要的。同時，優化選擇合適的檢測波長是有用的。

響應和校正因子的定義

如文獻[4]中論及，“響應因子”和“校正因子”表達的含義通常以不同的方式處理。根據歐洲藥典[5]，響應因子（或相對響應因子relative response factor，RRF）表示指定物質相對于標準物質的檢測器靈敏度，即相同濃度下雜質的檢測器響應與供試品的檢測器響應的比例。專論中給出的校正因子是響應因子的倒數，供試液采集得到的色譜圖中雜質峰面積必須乘以該校正因子。通常，響應因子使用以下表達式來計算：

RRF=（Ai/As）×（Cs/Ci）

RRF：響應因子；

Ai:雜質峰面積；

As:供試品的峰面積；

Cs：供試品的濃度，mg/ml；

Ci：雜質的濃度，mg/ml

為了進行計算，可以使用整個線性范圍內的峰面積比的平均值，或者使用雜質和供試品的線性回歸方程的斜率比值。

在歐洲藥典的技術指南中還討論了響應和校正因子的含義及正確的使用方法[6]。根據通則2.2.46色譜分離技術與指南，當雜質與供試品的響應值之比落在0.8~1.2范圍之外，必須對雜質峰面積進行校正，即在0.8~1.2范圍內不考慮響應值的差異。因此，在所有情況下，對于特定雜質，在專論的驗證過程中檢測到超出該范圍的響應因子，即校正因子也在該范圍之外，則在專論的有關物質部分中說明相應的校正因子。

然而，沒有提供關于如何確定響應和校正因子的指南。

響應因子的確定

響應因子可以通過制備一定濃度的雜質溶液和供試品溶液，在指定波長和流速下對這些溶液進行色譜分析，然后使用上述公式對峰面積進行比較來確定。理想情況下，雜質的濃度和供試品的濃度應在同一數量級上，并且應在雜質的接受標準濃度附近，測定的多點校正曲線進行計算。

然而，不僅要稱量相應量的雜質和供試品比較峰面積，非常重要的是，還要針對所測試物質的純度進行校正。理想情況下，應測定雜質和供試品的色譜純度、水分和殘留溶劑的量。含量將根據以下公式計算，該公式將遵循對照品賦值時相同的程序[3]：

含量（%）=[100-(水分+殘留溶劑)]×色譜純度百分比/100

上述提到的公式中Cs和Ci將根據雜質和供試品的含量進行校正：

RRF=（Ai/As）×（Cs×Ps/Ci×Pi）

RRF：響應因子；

Ai:雜質峰面積；

As:供試品的峰面積；

Cs：供試品的濃度，mg/ml；

Ps：供試品的含量，%；

Ci：雜質的濃度，mg/ml；

Pi：雜質的含量，%

由于響應因子的測定是方法驗證的一部分，因此應在至少2個實驗室進行驗證，最好使用相同的方案，以便獲得可比的結果。

測定中的一個限制因素通常是可用雜質的量。雖然希望以確定作為外標的雜質標準品相同的方式測定雜質的含量/純度，但可用的量通常很少。于是，分析人員可自行選擇消耗少量物質的方法，如用于測定水和/或溶劑的熱重法或庫侖法，以便仍能獲得科學有效的結果。使用不同類型的檢測器來確定響應因子也是有益的。

分析人員需要考慮的另一個重要問題是測定響應因子時雜質和供試品的形式（堿/酸或鹽）。只要兩者以相同的形式存在，即堿/堿或鹽/鹽，就可以這樣使用樣品的稱重量，但如果存在差異，則應在計算中引入分子質量比的附加校正因子（折算系數）。

例如，如果專論物質是堿，而雜質是酒石酸鹽（即具有相當大分子質量的反離子），則應將所稱雜質量乘以校正因子M鹽/M堿，并針對分子質量的差異進行校正。

確定和使用響應因子的限制和特定方面

不同吸收峰

理想情況下，雜質和供試品的最大吸收波長應相差不大，以便在任意物質的最大吸收或附近指定波長測定響應值。當雜質和供試品的吸收曲線相差很大時，可在供試品最大值處測量響應，但對于雜質，可能在吸收曲線的坡上測量。如圖1所示，在一條吸收曲線的最大值處測量意味著在第二條曲線的陡峭部分同時測量。因此，波長測量精度的微小變化可能會對雜質測定的吸光度產生強烈影響，而供試品測定的吸光度幾乎沒有變化。

在這方面，要提及通則2.2.25.紫外和可見吸收分光光度法[7]描述了波長校驗的允許公差，而2.2.29.液相色譜法包含一段關于檢測器的內容，但是沒有描述對波長或吸光度的控制。

在貫葉金絲桃提取物（St. John’s Wort dry extract, quantified）[8]專論中可以找到這個問題的解決方法。在這篇專論中，貫葉金絲桃素的含量是用液相色譜法以指定含量的蕓香苷三水合物標準品（即蘆丁）作為含量標準品測定的。為此，有必要描述貫葉金絲桃素相對于蘆丁的校正因子。貫葉金絲桃素在275nm處有最大吸收，蘆丁的紫外吸收曲線表現為陡峭的吸收曲線，即上述情況。

因此，校正系數是通過測量兩種不同波長下的響應來確定的，蘆丁為360 nm，貫葉金絲桃素為275 nm，在色譜運行期間（22分鐘），波長從360nm切換到275nm，以便在360nm處檢測到蘆丁和一些黃酮類化合物，在275nm處檢測到晚洗脫的貫葉金絲桃素和貫葉連翹素（圖2）。

雜質響應低

當雜質的響應遠低于供試品的響應時，觀察到一個特殊的問題，即雜質峰的面積必須乘以明顯大于1的校正因子。在這種情況下，可能會出現特定雜質存在在高于報告閾值（忽略限，通常為0.05%）的水平，但由于響應較低，相應的峰明顯低于該極限，因此當在應用校正因子之前應用報告閾值時，會忽略該峰。

例如，校正因子為10的雜質可能以0.2%的水平存在，但被錯誤地忽略，因為在乘以校正因子之前，對應的峰僅出現在0.02%的水平，即低于通常的報告閾值0.05%。

因此，在應用報告閾值之前，必須將峰面積乘以校正因子?？稍趯Ｕ撝性O計靈敏度試驗。為此，可以假設配制雜質的標準溶液，其濃度相當于雜質忽略限，并且要求最小信噪比（S/N）為10，相當于所得峰的定量限。如果使用自身對照溶液進行定量，則在相當于報告閾值的濃度下使用自身對照溶液獲得的峰的S/N應至少為校正因子的10倍（例如校正因子為4，則S/N要求應至少為40）。在靈敏度足夠好且雜質峰在報告閾值處的S/N值遠遠大于10的情況下，可能不需要進行該試驗。

響應/校正因子的使用限制

如上所述，需要高校正因子的低響應雜質，定量限可能會高于雜質的報告閾值。在這種情況下，應選擇不同的檢測波長。通常，當使用高校正因子時，定量測定的準確度降低，因為多次注入標準溶液或供試溶液的峰面積重復性對于小峰不如對于大峰好。因此，校正因子越高，測定的不確定度就越大。對于響應因子高的雜質，即校正因子低于1，則不會出現此問題。

因此，《歐洲藥典技術指南》[6]建議響應因子的下限為0.2。低于此值時，應考慮使用雜質外標或在不同檢測波長下進行測量。

結論

當有關雜質的量足以用外標法時，且響應因子在0.8至1.2范圍之外時，使用響應因子和校正因子通過液相色譜法測定雜質是一種有價值的方法。必須特別注意正確測定響應因子，以獲得樣品中雜質含量測定的可靠結果。這種方法的限制條件是雜質的響應因子非常低，最大吸收與待測物質相差很大。本文舉例說明如何解決這些問題。 

參考文獻

[1] Liquid chromatography, general chapter 2.2.29.Ph. Eur. 8th Edition. Strasbourg, France: Council of Europe; 2013.

[2] Control of impurities in substances forpharmaceutical use, general chapter 5.10. Ph. Eur. 8th Edition. Strasbourg,France: Council of Europe; 2013.

© Pharmeuropa | Useful information | August 2015 7

[3] Reference standards, general chapter 5.12. Ph.Eur. 8th Edition. Strasbourg, France: Council of Europe; 2013.

[4] Bhattacharyya L, Pappa H, Russo KA et al. Theuse of relative response factors to determine impurities. Pharmacopeial Forum 2005; 31(3):960-6.

[5] Chromatographic separation techniques, general chapter 2.2.46. Ph. Eur. 8th Edition. Strasbourg, France: Council of Europe;2013.

[6] Technical guide for the elaboration ofmonographs, 7th Edition. Strasbourg, France: Council of Europe; 2015.

[7] Absorption spectrophotometry, ultraviolet andvisible, general chapter 2.2.25. Ph. Eur. 8th Edition. Strasbourg, France:Council of Europe; 2013.

[8] St. John’s Wort dry extract, quantified,monograph 1874. Ph. Eur. 8th Edition. Strasbourg, France: Council of Europe;2013.