摘 要： 建立超高效液相色譜-串聯質譜聯用法測定丹桂香顆粒中馬兜鈴酸I的含量。采用ACQUITY UPLC® BHE C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱分離，以0.1%（體積分數）甲酸水溶液（含5 mmol/L甲酸銨）-乙腈作為流動相進行梯度洗脫，柱溫為30 ℃，流量為0.3 mL/min。在電噴霧離子源正離子模式，多反應監測模式下進行掃描檢測，以外標法定量。馬兜鈴酸I的質量濃度在0.1～40 ng/mL范圍內與色譜峰面積線性關系良好，相關系數為0.999 6。無糖型、含糖型樣品的平均回收率分別為89.4%、91.3%，測定結果的相對標準偏差分別為3.2%、1.2%（n=9）。該方法操作簡單、專屬性強、準確度高，可實現對丹桂香顆粒中馬兜鈴酸Ⅰ的定量檢測。

關鍵詞： 超高效液相色譜-串聯質譜法； 丹桂香顆粒； 馬兜鈴酸I

 

丹桂香顆粒是由炙黃芪、桂枝、吳茱萸、肉桂、細辛等二十三種藥材通過揮發油提取、乙醇提取和水煎煮工藝濃縮，后加入蔗糖(或不加蔗糖)與糊精噴霧而成。該顆粒具有益氣溫胃、散寒行氣、活血止痛之功效，臨床常用于脾胃虛寒、滯血瘀所致的胃脘痞滿疼痛、食欲減退、噯氣、腹脹以及慢性萎縮性胃炎等相關癥狀[1]。丹桂香顆粒處方中包含屬于馬兜鈴科的細辛植物。馬兜鈴科植物普遍含有馬兜鈴酸I成分。已有研究表明[2?15]，馬兜鈴酸I具有高度的腎毒性和致癌性，能夠誘導腺嘌呤和胸腺嘧啶交換，導致基因突變，從而引起肝癌，因此近年來，含馬兜鈴酸中藥的安全性問題引起廣泛關注。2003年，原國家食品藥品監督管理局要求將龍膽瀉肝丸處方中的關木通替換為木通，以避免關木通中的馬兜鈴酸對人體造成傷害。2012年，馬兜鈴酸被國際癌癥研究機構確定為I類致癌物[8?9]。此外，《中華人民共和國藥典》2015年版開始收載了細辛藥材及飲片的馬兜鈴酸I的限量檢查，以實現細辛中藥材及飲片的毒性成分質量管控。《中國藥典》2020年版對九味羌活丸中馬兜鈴酸I限量進行控制，但并未對其他含細辛中成藥馬兜鈴酸I成分進行規范。目前馬兜鈴酸I限量的檢測方法主要為液相色譜法[10?12]、高效液相色譜-串聯質譜法等[13?17]，因中成藥處方、工藝差異較大，上述方法無法直接應用至丹桂香顆粒中馬兜鈴酸I的成分測定。

筆者建立了超高效液相色譜-串聯質譜聯用法測定丹桂香顆粒中馬兜鈴酸I的含量，以丹桂香顆粒為研究對象，通過優化提取條件并研究基質對測試的干擾，對馬兜鈴酸I的含量進行了定量分析。該方法操作簡單、專屬性強、定性定量準確，為開發其他含細辛類中成藥中馬兜鈴酸I含量測定提供思路，確保藥品安全使用。

 

1. 實驗部分

 

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜-三重四極桿質譜聯用儀：ACQUITY XEVO TQ-S型，美國沃特世公司。

電子天平：XPE205型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司。

數控超聲清洗器：KQ-500DE型，昆山超聲儀器有限公司。

馬兜鈴酸I對照品：質量分數為99.1%，批號為110746-201912，中國食品藥品檢定研究院。

甲酸：色譜純，山東西亞化學股份有限公司。

甲酸銨：質譜純，美國ACS恩科化學公司。

乙腈：質譜純，美國賽默飛世爾公司。

丹桂香顆粒樣品：含糖型12批，編號分別為S1～S12，無糖型10批，編號分別為S13～S22，均來源于Z公司。

陰性樣品：按照中國藥典中丹桂香顆粒標準中的處方，不加細辛，其余按標準中的制法進行炮制，得到不含細辛的陰性樣品(含糖型/無糖型)。

實驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC® BHE C18柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國沃特世科技有限公司)；流動相：A相為乙腈，B相為0.1%（體積分數）甲酸溶液(含5 mmol/L的甲酸銨)，流量為0.3 mL/min；洗脫方式：梯度洗脫；洗脫程序：0～10 min時，流動相B的體積分數由65%逐漸減少到62%，10～10.5 min時，流動相B的體積分數由62%逐漸增加到65%，10.5～12 min時，流動相B的體積分數保持為65%；柱溫：30 ℃；進樣體積：1 μL。

1.2.2 質譜條件

離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描模式：正離子模式；監測模式：多反應監測掃描(MRM)；離子源溫度：110 ℃；脫溶劑氣溫度：4 50 ℃；錐孔氣：氮氣，流量為50 L/h；毛細管電壓：2.80 kV；碰撞電壓：10 V。定性離子對為m/z 359.0，296.0，定量離子對為m/z 359.0，297.9。

1.3 樣品處理

取丹桂香顆粒，研細，精密稱取2.7 g (含糖型)或3.6 g (無糖型)，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，稱定質量，超聲處理(功率240 W，頻率40 kHz) 30 min，放冷，再稱定質量，用70%甲醇補足減失的質量，搖勻，即得樣品溶液(含糖型/無糖型)。

1.4 溶液配制

標準儲備溶液：精密稱取馬兜鈴酸I對照品約10 mg，置于100 mL容量瓶中，加入70%甲醇溶解并定容至標線，搖勻；精密量取2.5 mL，置于50 mL容量瓶中，用70%甲醇稀釋至標線，搖勻；精密量取10 mL，置于200 mL容量瓶中，用70%甲醇稀釋至標線，搖勻，制得標準儲備溶液。

系列標準工作溶液：精密吸取標準儲備溶液0.04、0.08、0.2、0.4、0.8、2、4、8、16 mL分別置于100 mL容量瓶中，用70%甲醇作溶劑稀釋至標線，搖勻，得質量濃度分別為0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、40 ng/mL的系列標準工作溶液。

陰性樣品溶液：取陰性樣品，研細，取2.7 g (含糖型)或3.6 g (無糖型)，精密稱定，按1.3樣品處理方法，制成陰性樣品溶液。

陰性加標溶液：取陰性樣品，研細，取2.7 g (含糖型)或3.6 g (無糖型)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入20 ng/mL的馬兜鈴酸I標準儲備溶液25 mL，稱定質量，超聲處理(功率240 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定質量，用70%甲醇補足減失的質量，搖勻，即得陰性加標溶液(含糖型/無糖型)。

1.5 實驗步驟

分別取系列標準工作溶液，陰性樣品溶液和樣品溶液，注入液相色譜-質譜聯用儀中測定。分別以馬兜鈴酸I的質量濃度為橫坐標，對應的峰面積為縱坐標，進行線性回歸分析，以標準曲線法計算樣品中馬兜鈴酸I的含量。

 

2. 結果與討論

 

2.1 樣品提取條件優化

2.1.1 提取方式

取丹桂香顆粒，研細，按1.3樣品處理方式，分別采用加熱回流30 min和超聲提取30 min兩種提取方式，考察不同的提取方式對提取效率的影響，測定結果見表1。由表1可知，兩種方式的提取效率差異較小，鑒于超聲提取方法更加簡便，因此提取方法選取超聲提取法。

表1   不同提取方式的提取效率

Tab. 1   Examination of Extraction Methods

 

2.1.2 提取溶劑

按1.3樣品處理方式，分別采用50%甲醇、70%甲醇、甲醇作為提取溶劑，考察不同溶劑的提取效率，測定結果如圖1所示。從圖1中可以看出，70%甲醇溶液的提取效率最好，因此選擇70%甲醇作為提取溶劑。

圖1   不同提取溶劑的提取效率

Fig. 1   Extraction efficiency of different extraction solvents

2.1.3 提取時間

選擇70%甲醇作為提取溶劑，考察不同超聲提取時間對提取效率的影響，測定結果如圖2所示。從圖2中可以看出，超聲提取30 min時提取效率即達最高，因此選擇超聲提取時間為30 min。

圖2   不同提取時間的提取效率

Fig. 2   Extraction efficiency at different extraction times

2.1.4 提取溶劑體積

選擇70%甲醇作為提取溶劑，超聲提取30 min，考察不同提取溶劑體積提取溶劑對提取效率的影響，測定結果如圖3所示。從圖3中可以看出，25 mL 70%甲醇提取效率最高，因此選擇提取溶劑的體積為25 mL。

圖3   不同提取溶劑體積的提取效率

Fig. 3   Extraction efficiency of different extraction solvent volumes

2.2 流動相的選擇

以0.1%甲酸水溶液-乙腈體系作為流動相，結果發現離子對359.0，297.9和359.0，296.0的響應靈敏度較低，在0.1%甲酸水溶液中加入甲酸銨，增加了體系中銨離子濃度，電離強度增強，相應離子對靈敏度增加了4～5倍，因此最終選擇0.1%甲酸水溶液(含5 mmol/L甲酸銨)-乙腈體系作為流動相。

2.3 基質效應考察

采用Matuszewski等[18]報道的方法對基質效應進行評估。取標準溶液和陰性加標樣品溶液，在1.2儀器工作條件下分析檢測，得到陰性加標溶液和標準溶液的峰面積的相對偏差分別為0.4%(含糖型)和2.5%(無糖型)，基質效應為100.8%(含糖型)和95.3%(無糖型)，表明基質效應影響較小。

2.4 專屬性試驗

分別取標準溶液、陰性樣品溶液和樣品溶液，注入液相色譜-質譜聯用儀，記錄色譜圖，所得總離子流色譜圖如圖4所示。從圖4中可以看出，陰性樣品溶液譜圖中，在與馬兜鈴酸Ⅰ對照品色譜保留時間相同的位置上無相應離子流，表明處方中其它藥味對馬兜鈴酸Ⅰ的測定影響較小。

圖4   陰性樣品溶液、標準溶液、樣品溶液總離子流色譜圖

Fig. 4   Total ion flow chromatography of standard solution，sample solution and negative sample solution

 

2.5 線性方程與檢出限

分別精密量取系列混合標準工作溶液，在1.2儀器工作條件下進樣測定，以馬兜鈴酸I的質量濃度為橫坐標，對應的色譜峰面積為縱坐標，進行線性回歸分析，計算線性方程及相關系數。取質量濃度為1 ng/mL標準工作溶液，用70%甲醇逐級稀釋，在1.2儀器工作條件下測定，以3倍信噪比對應的質量濃度作為檢出限，以10倍信噪比對應的質量濃度作為定量限。結果表明，馬兜鈴酸的線性方程為y=1 151.3x-49.4，質量濃度的線性范圍在0.1～40 ng/mL之間與色譜峰面積線性關系良好，相關系數為0.999 6，方法檢出限為0.03 ng/mL，方法定量限為0.1 ng/mL。

2.6 加標回收與精密度試驗

精密稱取丹桂香顆粒細粉約3.6 g （無糖型，馬兜鈴酸I質量分數為0.015 9 mg/kg）和約2.7 g （含糖型，馬兜鈴酸I質量分數為0.020 0 mg/kg），各平行稱取9份，分別精密加入低、中、高水平（5、10、20 ng/mL）的對照品溶液各3份，加標回收與精密度試驗結果見表2。

表2   加標回收與精密度試驗結果

Tab. 2   Results of spiked recoveries and precision test

 

由表2可知，在無糖型和含糖型丹桂香顆粒中馬兜鈴酸I的平均回收率分別為89.4%、91.3%，測定結果的相對標準偏差分別為3.2%、1.2%(n=9)，表明該方法具有較高的準確度和精密度，可準確測定丹桂香顆粒中的馬兜鈴酸I含量。

2.6 穩定性試驗

取馬兜鈴酸Ⅰ標準溶液和樣品溶液(無糖型/有糖型)，于室溫下分別放置0、2、4、8、12、16、20、24 h，精密量取不同放置時間的上述溶液，在1.2儀器工作條件下測定，穩定性試驗結果見表3。

表3   穩定性試驗結果

Tab. 3   Results of stability test

 

由表3可知，標準溶液中馬兜鈴酸Ⅰ色譜峰面積的RSD為2.6%，樣品溶液中馬兜鈴酸Ⅰ色譜峰面積的相對標準偏差分別為2.6%(無糖型)、2.3%(含糖型)，表明標準溶液和樣品溶液均在24 h內穩定性良好。

 

3. 結語

 

建立了超高液相色譜-串聯質譜測定丹桂香顆粒中馬兜鈴酸Ⅰ的方法。該方法專屬性好、靈敏度高、準確度高、操作便利，可作為控制丹桂香顆粒中馬兜鈴酸Ⅰ限度的檢測方法，為丹桂香顆粒的安全使用提供保證。

 

參考文獻：

1 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（2020年版）［M］.北京：中國醫藥科技出版社，2020.

    Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of the People's Republic of China（2020 Edition）［M］.Beijing：China Medical Science Press，2020.

 

2 XIAN Zhong，TIAN Jingzhuo，ZHAO Yong，et al. Differences in p38-STAT3-S100 A11 signaling after the administration of aristolochic acid I and IVa may account for the disparity in their nephrotoxicity［J］. Phytomedicine，2023，114：154 815.

 

3 汪毅.基于REV-ERBα和鐵死亡的馬兜鈴酸I腎毒性機制研究［D］.廣州：暨南大學，2022.

    WANG Yi. REV-ERBα and ferroptosis based mechanistic studies on aristolochic acid Ⅰ-induced renal injury［D］. Guangzhou：Jinan University，2022.

 

4 MENG Xiao，ZHANG Mengping，LIU Lingfei，et al. Rapid and robust analysis of aristolochic acid I in Chinese medicinal herbal preparations by surface enhanced raman spectroscopy［J］. Spectrochimica Acta Part A：Molecular and Biomolecular Spectroscopy，2023，285：121 880.

 

5 曹雅靜，溫家欣，胡佳哲，等. HPLC-MS/MS法同時測定龍膽瀉肝丸中高毒成分馬兜鈴酸I與鬼臼毒素［J］.藥物流行病學雜志，2023，32（5）：522.

    CAO Yajing，WEN Jiaxin，HU Jiazhe，et al. Simultaneous determination of aristolochic acid I and podophyllotoxin in Longdan Xiegan pills by HPLC-MS/MS［J］. Chinese Journal of Pharmacoepidemiology，2023，32（5）：522.

 

6 諶晶晶，唐旭霞，徐慧芳，等.馬兜鈴酸對斑馬魚的耳毒性及腎毒性研究［J］.聽力學及言語疾病雜志，2020，28（1）：57.

    CHEN Jingjing，TANG Xuxia，XU Huifang，et al. The ototoxicity and nephrotoxicity of aristolochic acid in zebrafish［J］. Journal of Audiology and Speech Pathology，2020，28（1）：57.

 

7 朱哿瑞，王靜，黃愷，等.馬兜鈴酸Ⅰ致小鼠急性肝毒性的轉錄組學分析［J］.臨床肝膽病雜志，2021，37（10）：2 389.

    ZHU Gerui，WANG Jing，Huang Kai，et al. A transcriptomic analysis of acute hepatotoxicity induced by aristolochic acid I in mice［J］. Journal of Clinical Hepatology ，2021，37（10）：2 389.

 

8 宗時宇，劉洋，孫婷婷，等.細辛毒性及其控制方法研究進展［J］.中國藥師，2020，23（5）：154.

    ZONG Shiyu，LIU Yang，SUN Tingting，et al. Research progress in the toxicity and control methods of Asari Radix et Rhizoma［J］. China Pharmacist，2020，23（5）：154.

 

9 張翠英，俞捷，劉廣學，等.3種馬兜鈴酸和2種馬兜鈴內酰胺在北細辛、華細辛及漢城細辛不同部位的分布及含量分析［J］.世界科學技術-中醫藥現代化，2019，21（7）：1 295.

    ZHANG Cuiying，YU Jie，LIU Guangxue，et al. Distribution and content of 3 aristolochic acids and 2 aristololactams in different parts of Asarum heterotropoides var. mandshuricum，A. sieboldii and A. sieboldiivar. seoulense［J］. World Science and Technology Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica，2019，21（7）：1 301.

 

10 劉靜，戴忠，程顯隆，等.馬兜鈴酸類成分檢測與分析研究進展［J］.藥物評價研究，2019，42（8）：1 644.

    LIU Jing，DAI Zhong，CHENG Xianlong，et al. Research progress on detection and analysis of aristolochic acids［J］. Drug Evaluation Research，2019，42（8）：1 644.

 

11 龐逸輝，李岳，張憲.高效液相色譜法測定杜仲壯骨丸中馬兜鈴酸A［J］.化學分析計量.2022，31（6）：50.

    PANG Yihui，LI Yue，ZHANG Xian. Determination of aristolochic acid A in Eucommia Ulmoides Strong Bone Pill by high performance liquid chromatography［J］. Chemical Analysis and Meterage， 2022，31（6）：50.

 

12 黃曉燕，李榮瑋，曾蒲軍，等.十三味疏肝膠囊中馬兜鈴酸A的檢測方法研究［J］.藥品評價，2021，18（23）：1 421.

    HUANG Xiaoyan，LI Rongwei，ZENG Pujun，et al. Determination of Aristolochic Acid A in Shisanwei Shugan Capsules［J］. Drug Evaluation，2021，18（23）：1 421.

 

13 李靖云，孫輝，丁野，等. UPLC-MS/MS同時測定京制咳嗽痰喘丸中馬兜鈴酸Ⅰ、Ⅱ的含量［J］.亞太傳統醫藥，2024，20（4）：16.

    LI Jingyun，SUN Hui，DING Ye，et al. Simultaneous determination of aristolochic acid Ⅰand Ⅱin Jingzhi Kesou Tanchuan Pills by UPLC-MS/MS［J］. Asia-Pacific Traditional Medicine，2024，20（4）：16.

 

14 王穎，劉繁紅，楊燕麗，等. UPLC-MS/MS測定追風透骨丸中馬兜鈴酸類成分含量［J］.中國現代中藥，2023，25（10）：2 207.

    WANG Ying，LIU Fanhong，YANG Yanli，et al. Determination of aristolochic acids and their derivates in Zhuifeng Tougu Pills by UPLC-MS/MS［J］. Modern Chinese Medicine，2023，25（10）：2 207.

 

15 畢武，梁晟，孫輝，等.超高效液相色譜-串聯質譜法測定止咳化痰丸中馬兜鈴酸I和馬兜鈴酸Ⅱ的含量［J］.中獸醫醫藥雜志，2023，42（6）：21.

    BI Wu，LIANG Sheng，SUN Hui，et al. Determination of aristolochic acid Ⅰ and aristolochic Ⅱ in Zhisou Huatan pills by ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry［J］. Journal of Traditional Chinese Veterinary Medicine，2023，42（6）：21.

 

16 周穎，鄭成，戴忠，等.超高效液相-串聯質譜法測定鎮腦寧膠囊中7種馬兜鈴酸類成分［J］.中國藥學雜志，2023，58（21）：1 955.

    ZHOU Ying，ZHENG Cheng，DAI Zhong，et al. Simultaneous Determination of seven aristolochic acid analogues in zhennaoning capsules by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］. Chinese Pharmaceutical Journal，2023，58（21）：1 955.

 

17 郭寧，趙雍，孫奕，等.朱砂蓮中馬兜鈴酸類成分的UPLC-QTOF-MS/MS定性與定量分析［J］.中國實驗方劑學雜志，2021，7（11）：162.

    GUO Ning，ZHAO Yong，SUN Yi，et al. Qualitative and quantitative analysis of aristolochic acids in aristolochia cinnabarina dried root tubers by UPLC-QTOF-MS/MS［J］. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae，2021，27（11）：162.

 

18 WASIK A，MCOURT J，BUCHGRABER M. Simultaneous determination of nine intense sweeteners in foodstuffs by high performance liquid chromatography and evaporative light scattering detection development and single laboratory validation［J］. Journal of Chromatography A，2007，1 157（1-2）：187.

 

引用本文： 程慶兵，汪海宣，鄭正，等 . 超高效液相色譜-串聯質譜法測定丹桂香顆粒中痕量馬兜鈴酸I［J］. 化學分析計量，2024，33（11）：52. (CHENG Qingbing, WANG Haixuan, ZHENG Zheng, et al. Determination of trace aristolochic acid I in Danguixiang Granules by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2024, 33(11): 52.)