腫瘤是以細胞不可控的生長和傳播為特點，并最終導致機體的死亡。腫瘤的發生既可以來自于外部因素如輻射、致癌化合物暴露、微生物感染或一些物理作用，也可以來自內部如基因突變、激素、免疫功能抑制等。藥物潛在致癌機制也是多種多樣，所以需要在上市前對致癌風險進行評估，并根據情況完成相關研究。

先看下監管機構對藥物致癌性試驗的要求。對于用藥周期達到3個月或更久的藥物，FDA要求在上市前提交致癌性研究資料。日本和歐洲則要求6個月及以上的藥物提供。后續ICH將這一藥物暴露周期也定在6個月。當然，如果在短期暴露或非頻繁給藥情況下，出現了致癌方面的擔憂，如遺傳毒性結果陽性，構效關系提示致癌風險，短期重復給藥試驗發現癌前病變或同類產品已觀測到人類致癌風險等，那就不能按照6個月這一條件決定致癌試驗開展與否了。

內源性多肽、蛋白或其類似物通常不需要開展致癌性試驗。但是，如果藥物與內源性成分生物學作用迥異，或藥物經過修飾導致結構與內源性成分完全不同，或藥物暴露量較內源性成分高很多，則還是需要進行致癌性評估。

并不是所有藥物均需要開展2年大鼠致癌性研究。ICH S1認為如果從藥物靶點、信號通路、毒理學研究等綜合分析，認為藥物致癌風險很低，或者明確有致癌風險，則2年大鼠致癌試驗開展的意義并不大。證據權重分析（WoE）分析維度如下圖所示，從靶點生物學作用、次要藥效學、重復給藥毒性研究結果、對激素的影響、遺傳毒性和免疫調節作用，綜合評估可能的致癌風險。對于“likely”和“unlikely”兩種情況，額外開展2年大鼠致癌研究并無意義。對于不確定的情況，則需要開展大鼠2年致癌試驗。

不過小鼠致癌試驗往往通常還是要開展的，即使WoE認為藥物人體潛在致癌風險為“unlikely”。根據動物“3R”原則，建議優先選擇轉基因動物模型。當然，某些情況下，小鼠試驗也可以不進行，比如WoE提示藥物致癌風險低，且小鼠中達不到人體治療劑量下的暴露水平。又如WoE提示藥物很可能是人體致癌物，小鼠試驗也不適合繼續開展。

種屬選擇

致癌性試驗常規使用的是兩種嚙齒類動物組合，小鼠和大鼠。小鼠最常用的種系是CD-1，其他品系如B6C3D1、CF-1、NMRI、C57B1、Balb/c則用的相對較少。大鼠最常用的是SD大鼠，某些企業喜歡用Hans Wistar、Fischer344（F344），Long Evans和CFE用的很少。那如果大鼠和小鼠都不合適呢，倉鼠（hamster）作為替補隊員就上場了。都是嚙齒類種屬，為啥要用兩種動物進行致癌評估呢？因為基于過往認知，沒有任一種屬能夠充分預測人體致癌風險。如果兩種種屬均未發現致癌風險，結果的可靠性要強于單一種屬。關于兩個種屬之間致癌結果是否一致問題，不同數據來源出入挺大的，Purchase、Haseman、Gold團隊公布的這一數據分別是82%、73%、30-40%。無論如何，任一嚙齒類種屬致癌性結果并不能用于預測另外一種嚙齒類動物，所以雙種屬致癌性試驗組合還是會繼續延續。

種屬選擇的考量因素有很多，除了傳統的相關種屬判定，動物自發腫瘤、生存期、充分的背景數據等也需要作為選擇標準。而且，不同嚙齒類品系各種類型的腫瘤發生率區別很大，以最常用的SD大鼠為例，老年雌性SD大鼠有很高的乳腺癌發病率，且很多動物因為這個原因在致癌性試驗中的第二年死亡。F344大鼠雖然乳腺癌發病率低很多，但睪丸腫瘤的發病率接近100%。自發性腫瘤會很大程度上影響致癌性結果的判定，首先如果受試物引發的某種腫瘤在該種屬中自發率很高，則會有很高的背景噪音，評價難度增加。其次，即使結果顯示較背景數據高很多，也可能是這個種屬對該腫瘤比較敏感，畢竟有很高的自發率，對于能否預測人體情況，也很難判定。除自發性腫瘤，動物生存期也需重點考慮，正常需要考察藥物在其正常生命周期暴露后引發的潛在致癌風險。如果動物在試驗期間死亡，則不能提供足夠的腫瘤形成周期，整個試驗的靈敏度也降低，假陰性的概率則會增加。另外，還需要積累充分的背景數據，輔助致癌結果的判定，比如CD-1小鼠脾臟、肝臟、腎臟、甲狀腺、腎上腺有比較高的淀粉樣變性自發病變。

動物飼養

致癌試驗以周期長和花費高著稱。這期間動物護理非常重要，也會極大影響試驗質量。各種物理、生物學因素引入的風險需要仔細評估。物理因素包括光、溫度、相對濕度、通風、噪音、飲食、居住條件等，生物因素諸如細菌和病毒可能引起感染和其他疾病。例如光照持續時間、強度和光源質量會影響動物腫瘤發病率。光強過大會引起動物眼部損傷。居住在高排和側面籠位的動物受影響最大。室溫異常會使小鼠皮膚腫瘤發生率增加。相對濕度改變則會影響動物飲水和攝食。低的濕度還會引發動物“ringtail”（環尾）。嚙齒類動物致癌試驗中的理想飲食要營養充分，但又不能營養過剩。FDA研究發現，現在大鼠的壽命在降低，與飲食有很大關系。

飼養籠的類型和墊料也會影響小鼠皮膚腫瘤的發病率和發病周期。DePass團隊1986年研究顯示，不銹鋼籠子和聚碳酸酯籠盒飼養的小鼠，后者腫瘤發生的更早，且發生率也更高。

給藥組數量

致癌試驗通常設置對照組和3-4個劑量水平的給藥組。一是如果致癌陽性，可以充分考察劑量-反應關系。二是畢竟致癌試驗周期太長，風險也很高，如果最高劑量組動物出現過量死亡，還有充分的劑量水平用于評估。

對照組數量

與其它毒理試驗通常僅設置1組對照不同，致癌試驗常用的是設置2個對照組，每組動物數相同。當然，也有設置1個對照組，動物數量與給藥組一樣的設計。還有一種比較少用的設計，設置1個對照組，數量是給藥組的2倍。

使用兩組對照的優勢是可以評估兩組之間的自發腫瘤的變異情況。假如兩組間無差異，數據可以合并使用，這種情況下兩個對照組和一個對照組的設計就沒有區別。假如兩組間有差異，則必須將給藥組的數據與兩個對照組分別進行對比。那如果對比完發現，給藥組某個腫瘤發生率比其中一個對照組高，跟另外一個對照組相似怎么辦呢？這就需要結合歷史背景對照數據進行分析。

劑量設計標準

劑量設計本來就是毒理研究的重要考量點，對于致癌試驗那就更是重中之重了。畢竟，急毒或短期劑量探索試驗劑量設計不合理還有后續重復給藥毒理試驗補救，致癌試驗就沒有這種機會了。尤其當致癌試驗后期才暴露這一問題，就更討厭了。

大部分藥企劑量設計的原則是，高劑量為最大耐受劑量（MTD），低劑量是最大臨床推薦劑量（MRHD）的1-5倍，中劑量為兩個劑量之間的幾何平均值。ICH（1995）對MTD描述“that dose which is predicted to produce a minimum toxic effect over the course of the carcinogenicity study, usually predicted from the results of a 90-day study”。MTD如果設計合理，首先不會影響動物的生存期，其次對動物體重增長有中等影響，并產生一定的毒性癥狀。對于沒有毒性的藥物，按照傳統MTD的高劑量設計思路，高劑量和低劑量可能會差好幾個數量級。有些指南不建議高低劑量相差超過10倍，這種情況下可以將高劑量定為MRHD的100倍。其實，按照低劑量是MRHD的1-5倍計，已經有些超出10倍的要求了。對于摻食給藥的情況，日本監管機構規定，即使MTD還沒達到，高劑量組藥物在飲食中的比例不應超過5%。

當然，劑量選擇時還要考慮藥物藥代動力學特點，不建議選擇的高劑量在排泄方式上與低劑量有很大不同。代謝角度的考量也是類似的，不建議高劑量產生的代謝產物與低劑量有很大不同。另外，如果藥物在某個劑量已經達到最大暴露，也不建議繼續提高給藥劑量。

每組動物數

建議每組每性別至少50只。大部分企業選擇這一最低數量，也有企業選擇80只/性別/組。決定動物數量多少的核心要素是在試驗終點時，保證有足夠數量的動物用于致癌性評估。尤其是每天灌胃給藥的情況，有可能因對食管造成的損傷或藥物誤入氣管，引起動物非正常死亡，更需要每組多設置一些動物。還有些情況是致癌性試驗和慢性毒性試驗合并開展，需要在第6和12個月時處死一些動物，用于潛在的一般毒性評估，也需要每組的樣本量更大。

給藥途徑

最常見的兩種給藥途徑是摻食和灌胃。其它給藥途徑包括皮膚用藥、摻入飲水、注射給藥，視臨床擬用途徑而定。如果候選藥物臨床給藥途徑不只一種，通常建議摻食給藥。摻食的好處是節約人力，畢竟每天灌胃幾百上千只動物是不小的工作量。另外，有研究顯示摻食不會像灌胃那樣，過高估計MTD。不過，如果藥物在嚙齒類飲食中不穩定或影響動物正常攝食，就另當別論了。摻食另外一個缺點是給藥劑量只能靠動物體重和攝食數據計算，不像灌胃給藥劑量那么準確。

試驗周期

通常，大小鼠致癌性試驗周期都是2年。偶爾也有大鼠周期延長至30個月，小鼠周期縮短至18個月。出現這種區別的原因是過去認為大鼠的壽命比小鼠更長。不過，很多研究已經證實SD大鼠和CD-1小鼠的生存期都是2年左右。其它品系，如F344大鼠和B6C3F1小鼠，也是一樣的2年壽命。

生存期

為確保能觀察到某些遲發腫瘤（比如某些弱致癌物），受試藥物需要盡可能久的暴露在動物的生命周期中，這就需要動物要活的足夠久。如果動物在早期出現非腫瘤原因導致的死亡，會影響試驗的質量和試驗目的的達成。很多時候是致癌物的致癌潛力越弱，觀察到腫瘤發生的時間越晚。致癌物的劑量越低，觀察到腫瘤發生的時間同樣也晚。所以，動物生存期是致癌性試驗需要重點關注的。關于動物最低生存期，沒有統一要求。FDA Redbook II Draft Guideline建議大鼠、小鼠或倉鼠要給藥24個月。EEC guideline則認為對照組存活率達到20%時，就可以結束試驗。日本監管機構則認為對照組或低劑量組存活率還剩25%時，就可以結束研究。

試驗終點檢查

致癌試驗的終點比慢性毒理試驗更為聚焦，終點指標更少。關鍵終點包括病理學、體重、生存期、臨床病理、攝食量。標準病理組織清單如下：

致癌數據的評估需要關注以下變化：1）劑量-反應關系；2）腫瘤常見器官中的間變性腫瘤變化趨勢；3）腫瘤出現時間更早的趨勢；4）存在癌前病變的跡象。

致癌試驗陽性結果的判定通常有3個標準，分別是1）常見腫瘤出現統計學意義的增加；2）腫瘤出現的時間明顯提前；3）雖然無統計學意義，但出現非常罕見腫瘤，也判為陽性。前兩個是基于統計學分析進行判定。

最后再介紹下4款常見的轉基因小鼠。

致癌試驗的常規組合是大鼠和小鼠2年給藥致癌研究。但這種動物全生命周期給藥的方式也常常遭受質疑。因此，1997年ICH提供了一種中期或短期小鼠試驗，以替代小鼠2年全生命周期的研究。之后，FDA對于基于轉基因小鼠開展中等周期致癌試驗也逐漸接受。當然，轉基因小鼠有充分的驗證數據。目前驗證最為充分，使用較多的是4種轉基因小鼠模型，分別是TSPp53+/-、Tg.AC、Hras2和XPA-/-。每種模型都有其獨特的特點。

Tg.AC小鼠模型

這是最早被開發出來的轉基因致癌小鼠模型。早在1990年就被報道用于小鼠皮膚致癌性試驗。這個小鼠體內11號染色體上有4個拷貝的v-H-ras致癌基因，并與啟動子ζ-globin基因進行了融合。改造的基因與小鼠皮膚的快速成瘤有關。將一些潛在致癌物用于皮膚表面可以較短時間誘導出乳頭狀瘤。40%的乳頭狀瘤會進一步發展為皮膚惡性腫瘤，主要是鱗狀細胞癌和肉瘤。

該模型在美國被美國環境健康科學研究所（NIEHS）和美國國家毒理學計劃（NTP）首次用于替代傳統致癌試驗。這一試驗中有40種化合物被用于致癌性測試，并最終發表，算是開了短期試驗替代傳統長期致癌研究的先河。無論皮膚受試物還是需系統給藥的化合物，大多數使用Tg.AC小鼠模型開展的致癌試驗均采用皮膚給藥。這就要求對皮膚的處理要比較精細、小心，因為皮膚損傷也會形成乳頭狀瘤。

這個模型的問題是，并不是所有擬系統給藥的藥物均適合經皮途徑給藥。這也是為什么國際生命科學學會（ILSI）啟動了一項在該模型中經皮和系統雙給藥途徑研究計劃。另外，該模型還會發生對陽性對照致癌物不響應的情況，原因與ζ-globin啟動子重排有關。不過，據稱這一問題已得到解決。

Tg.rasH2模型

該模型由日本實驗動物中央研究所（CIEA）研發，并于1990年首次對外披露信息。該模型小鼠的改造策略是將5或6個拷貝的人H-ras原癌基因以串聯的形式插入基因組。Tg.rasH2小鼠非常穩定，自模型開發成功以來，從未出現過響應缺失的情況。該模型編碼的開關蛋白與Tg.AC小鼠類似，但不同的Tg.rasH2小鼠轉入的基因在所有器官和組織均表達，不僅限于皮膚。

采用N-甲基-N-亞硝脲（MNU）給予該小鼠，可快速誘導前胃乳頭狀瘤的出現。故，MNU后續常作為Tg.rasH2小鼠致癌性研究的陽性對照物。通常，采用Tg.rasH2小鼠開展的致癌試驗，6個月給藥周期就足夠了。因為這個節點動物已經出現各種自發性腫瘤，如脾臟血管肉瘤、前胃和皮膚乳頭狀瘤、肺腺癌和Harderian gland腺癌以及淋巴瘤。與其它致癌小鼠模型相比，這個模型特點是對致癌物的反應非常強烈，直接表現是一旦接觸致癌物，陽性反應出現的更早、發生率也更高。具體機制尚不清楚。

雖然Tg.rasH2對少部分化合物給出的結果模棱兩可，但不可否認的是，大多數非致癌物均能在該模型得到客觀、正確的鑒定。Tg.rasH2是目前轉基因致癌小鼠模型中最受歡迎的。

P53+/-小鼠模型

TSP P53+/-雜合子敲除小鼠模型由美國開發。P53基因是最重要的腫瘤抑制因子之一，惡性腫瘤中經常能看到該基因的突變。當DNA鏈受損時，該因子會激活多個基因，這反過來會導致DNA修復時細胞周期的停滯，或者導致細胞凋亡（程序性細胞死亡），從而清除受損細胞。之所以使用雜合子，是因為純合子在出生后幾個月內自發性腫瘤的發生率非常高。雜合子在長達12個月內的腫瘤背景發病率較低，但在這段時間內，如果動物給予致癌物，進一步發生p53基因突變事件的可能性很高。從而導致抑癌功能的完全喪失，惡性腫瘤發生風險升高。

最早是由美國NIEHS采用該模型進行了致癌性研究，希望作為傳統致癌體系的備選之一。結果發現該模型對致突變致癌物苯和甲基苯胺是敏感的，6個月內即出現陽性結果。但是，ILSI后續研究發現，該模型6個月的給藥周期可能是不充分的。尤其是苯，6個月出現陰性或模棱兩可的結果，9個月才出現比較確定的陽性結果。另外，非致突變致癌物和致突變非致癌物在該模型中均呈現陰性結果。

P53+/-小鼠是美國最為流行的轉基因致癌模型。

XPA-/-小鼠模型

XPA基因的兩個等位基因均通過ES細胞中的同源重組而失活，導致跨外顯子3和4的基因純合缺失。該基因編碼的蛋白可以通過NER通路，檢測并修復DNA損傷。XPA-/-小鼠模型僅殘留了2%-5%的NER活性。荷蘭國家公共衛生及環境研究院（RIVM）1995年首次發表了該模型的數據。發現，XPA-/-小鼠暴露于IV-B放射或7,12-二甲基苯[α]蒽后可快速誘導皮膚腫瘤的發生。經口給予其它致突變致癌物后，可以誘導多種體內腫瘤的發生。早期研究認為6個月足以觀察到腫瘤發生，后續更多試驗表明9個月對某些陽性藥物才更為充分如B[α]P, 2-AAF. XPA-/-小鼠對UV、基因毒性致癌物和非基因毒性致癌物都是敏感的。而且，非致癌物在該模型中未見假陽性結果的出現。

還有一種XPA-/-P53+/-雙轉基因小鼠，這個動物對致癌物更為敏感。比如DES（己烯雌酚）開展的一項研究中，XPA-/-P53+/-雙轉基因小鼠出現7個動物轉移性骨肉瘤，XPA-/-小鼠僅1只。但這一模型有可能過于敏感，出現致癌陽性結果與人體風險之間的相關性存疑。

ICH S1B(1997)已經將以上模型寫入了指導原則中，用于替代傳統長期小鼠致癌試驗。當然，傳統大鼠致癌試驗還是要開展的。FDA對轉基因模型也是持開放態度。甚至， FDA CBER對于遺傳毒性結果陰性，且從作用機制角度沒有太多擔憂，單一種屬轉基因動物模型，也有接受的案例。