摘要

如何應對突發性大規模傳染疾病已成為全球范圍內的研究熱點，美國FDA緊急批準上市的首款mRNA疫苗BNT162b2對新型冠狀病毒展現出了良好的療效，不僅為突發性傳染病提供新的解決思路，在藥物研發領域也引起了廣泛關注。然而，mRNA分子結構不穩定，需要借助載體才能進入目標靶位發揮藥效。mRNA藥物遞送載體成分復雜，是引起藥物不良反應的主要因素，可能會引發不同類型的不良反應，如免疫反應、炎癥反應等。本文主要探討mRNA藥物相關載體中潛在的安全性風險，以及在非臨床安全評價中的考慮要點和參考案例，為探索和構建mRNA藥物的科學的安全性評價方法提供參考。

關鍵詞

mRNA藥物; 載體; 毒性; 非臨床安全評價; 不良反應

mRNA藥物是一類通過遞送系統將編碼好的外源mRNA遞送進入細胞內部，并由宿主翻譯系統表達特定功能蛋白，從而實現預防疾病或治療作用的生物制劑。作為一類極具前景的新型藥物，mRNA藥物相較于傳統藥物的優勢有以下幾點: ①藥物研發周期短，能夠快速響應突發性疫情。②安全性高，在載體的輔助下，mRNA藥物于細胞質發揮功能，不會整合進入宿主基因組[1]。③mRNA藥物產物為蛋白質，能夠通過生物代謝途徑被完全降解[1]。④mRNA疫苗具有佐劑效應，能夠有效提高機體免疫應答能力，進一步增強機體免疫力[2]。mRNA藥物由mRNA分子與納米載體構成，mRNA分子包含5'端帽結構、3'端帽結構與Poly(A)尾、開放閱讀框(open reading frame，ORF)及其周圍的5'非翻譯區(5'untranslated region，5'UTR)和3'非翻譯區(3'un translated region，3'UTR)構成。兩端的帽子結構和Poly(A)尾能夠影響mRNA的穩定性和翻譯效率[3]，5'UTRs和3'UTRs能夠提高藥物表達水平、翻譯效率和半衰期[4]，見圖1。mRNA分子為天然產物，對機體產生的毒性較小，主要的毒性由藥物載體引起，mRNA藥物遞送載體目前主要為脂質納米顆粒(lipid nanoparticles，LNPs)，在研的遞送載體有無機納米顆粒載體、外泌體、病毒樣納米顆粒載體等。迄今為止，共有15款mRNA藥物獲批上市(見表1)，其中包括美國FDA批準的疫苗: 輝瑞和BioN Tech聯合研發的首個新型冠狀病毒(以下簡稱“新冠病毒”)疫苗復必泰，以及由Moderna研發的新冠病毒疫苗Spikevax和首個非新冠病毒適應證疫苗mRESVIA等。在中國，國家藥品監督管理局批準了中國石藥集團有限公司、中國斯微生物科技股份有限公司和中國艾博生物等研發的新冠病毒疫苗共8款產品。

mRNA藥物作為近年來藥物研發領域的熱點之一，有許多藥物處于臨床前研發階段，藥物在臨床前的安全性評價數據相對有限。本文通過深入探討不同載體系統的潛在毒性、作用機制并對載體的安全性評價方法進行了系統梳理，為探索和建立適用于mRNA藥物的安全性評價科學方法提供參考。

1潛在安全性風險

1.1 LNPs載體的毒性風險

1.1.1 不良免疫效應

LNPs由輔助脂質、膽固醇、聚乙二醇化脂質(PEGylated lipids，PEGs)、可電離的陽離子脂質混合而成[5]。輔助脂質和膽固醇具有結構支撐和穩定作用，PEGs會促進LNPs的穩定性，可電離的陽離子脂質能與帶負電荷的mRNA分子結合，促進mRNA分子從內核體轉入細胞質中，進而與核糖體結合，翻譯出相關蛋白質[6]。PEGs是LNPs中引起免疫相關不良反應的主要成分[7]，其具有免疫原性，會導致一種補體相關的類過敏反應(CARPA)。PEG化藥物會導致患者體內抗PEG的IgM和IgG上升，這些抗藥抗體會中和藥物，降低藥物的臨床療效。此外，由PEG化藥物產生的抗藥性抗體，會加速藥物的血液清除，導致療效降低和超敏反應或遲發型超敏反應[8]，甚至過敏性休克和死亡。mRNA疫苗tozinameran和CX-024414是歐盟使用的2種新冠病毒疫苗，接種疫苗的部分患者出現心肌炎或心包炎[9]，研究發現每100萬例接種疫苗CX-024414的患者出現心肌炎的概率為17.27例，出現心包炎的概率為9.76例; 每100萬例接種tozinameran疫苗的患者發現心肌炎的概率為8.44例，出現心包炎的概率為5.79例。有觀點認為是疫苗接種后引起炎癥發生所致的不良反應[10]，還有觀點認為疫苗接種的強效免疫原性RNA可能對心臟有旁觀者效應或輔助作用[11]。

1.1.2 炎癥反應

在mRNA藥物Spikevax的評估報告中提到mRNA-LNP疫苗肌肉注射后可在腦內檢測到極低水平的mRNA，這預示著mRNA-LNP復合物能夠跨越血腦屏障，到達神經系統，但未檢測到神經系統不良反應。mRNA-LNP疫苗會引起強大的體液免疫反應，導致接種部位產生急性炎癥不良反應，如疼痛、腫脹、發熱等[12]，可能與陽離子脂質引起的炎性反應有關。陽離子脂質的炎癥反應表現為肌肉疼痛、頭疼和高熱[13]，這可能與陽離子脂質誘導以補體激活和細胞因子IFN-γ，TNF-α，IL-6，IL-12誘導為特征的強烈的炎性反應有關[14]。

1.1.3 其他不良反應

陽離子脂質引起的不良反應主要包括細胞毒性、炎癥反應、肝毒性、白細胞減少、血小板減少等[15]。陽離子脂質表面具有高密度的正電荷，會導致大量的活性氧(ROS)生成[16]，ROS誘導細胞毒性和細胞凋亡[17]，降低細胞膜的穩定性，影響細胞膜上的離子通道與信號傳導系統[18]。陽離子脂質還能夠進入細胞內部，與細胞器膜相互作用，影響膜的完整性和功能，進而影響細胞的正常的生理功能。陽離子脂質的肝毒性主要表現為血清轉氨酶升高，如谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶。庫普弗細胞會吞噬脂質復合物，是LNPs在肝中蓄積的主要原因[13]。血液學檢查表現為白細胞減少和血小板減少。

1.2 外泌體納米顆粒載體的毒性風險

外泌體是細胞分泌的傳遞信息的納米級囊泡[19]，其直徑在40~160nm之間，因其具有良好的耐受性和生物相容性和較低的免疫原性[20]，被認為是一種極具前景的納米藥物遞送載體。外泌體作為藥物載體使用，已經用于免疫系統疾病、腎損傷疾病、癌癥等多種疾病的藥物治療研究。需對其安全性進行評估，外泌體可能具有神經毒性和生殖毒性風險，作為納米顆粒載體，其納米尺寸可能使其具有穿透血腦屏障的能力，從而引發神經毒性[21]。免疫原性也是外泌體可能存在的毒性風險，外泌體的組分復雜，經過特殊靶向修飾后可能導致免疫原性和免疫毒性。

1.3 無機納米顆粒載體的毒性風險

1.3.1 肝臟和腎臟毒性

無機納米顆粒是一種穩定性高、生物相容性良好、不良反應小的新型藥物載體，種類豐富，包含有銀納米顆粒、金納米顆粒、氧化鐵納米顆粒等。無機納米顆粒對人體重要器官可能存在潛在的風險，包括肝臟、腎臟[22]、大腦、睪丸和心臟[23]。研究表明，金屬納米顆粒會在肝臟中蓄積，會導致肝毒性，損害肝功能[24]，還會誘導肝臟的氧化應激和炎癥，進而導致肝損傷。腎臟也會受納米顆粒誘導產生腎毒性、腎臟炎癥和功能障礙[25]。納米顆粒所導致的毒性可能與多種細胞超微結構改變有關，包括線粒體、內質網、溶酶體、質膜、高爾基體和細胞核[26]。金屬納米顆粒毒性的產生與線粒體超微結構的改變有關，因為線粒體是ATP生成、凋亡調節、ROS清除以及與其他細胞器相互作用的主要場所，承擔著維持細胞功能的重要作用。Jarrar等[27]研究表明，銀納米顆粒可以誘導肝臟細胞線粒體超微結構發生改變，如肝細胞線粒體呈多形性、基質透明和嵴斷裂。納米銀顆粒也會導致腎臟細胞超微結構變化，如近曲小管細胞刷狀緣微絨毛密集。金納米顆粒會導致肝細胞線粒體損傷，表現為腫脹、透亮基質和膜破裂，對腎臟的影響為腎臟遠曲小管細胞出現線粒體腫脹、嵴溶解、偶見線粒體膜破裂。線粒體超微結構的改變表明線粒體滲透壓和線粒體膜的完整性發生改變，進而影響到線粒體的功能。無機納米顆粒會通過氧化應激、免疫系統激活和大分子相互作用等不同機制誘導線粒體損傷。

1.3.2 遺傳毒性

無機納米顆粒產生生物毒性的因素有多種，如物理損傷、生物相互作用等。因為無機納米顆粒的粒徑較小，易于浸潤細胞內部，對細胞膜結構產生破壞，進入胞質中的無機納米顆粒主要存在于胞質中，會干擾細胞的代謝功能，甚至引發細胞凋亡或壞死。納米顆粒還會產生ROS自由基，導致氧化應激和炎癥反應，進一步加劇細胞損傷。

1.4 病毒樣顆粒(virus-like particles，VLPs)載體的毒性風險

VLPs是一種復雜的多聚體，具有能夠進行自組裝的蛋白質結構，直徑為20~200nm，病毒樣顆粒與天然病毒的形態相似但不包含親代病原體的物質，mRNA與VLPs上的衣殼蛋白特異性結合即可形成VLP-mRNA復合物，由于復合物粒徑較小，易于進入細胞內部發揮藥效。VLPs常見的局部不良反應有注射部位疼痛、腫脹，該不良反應與VLPs刺激機體所產生強烈的炎癥反應相關[28]。全身不良反應有疲勞、胃腸系統癥狀和頭痛。

1.5 其他納米顆粒載體的毒性風險

仿生納米顆粒載體的組成結構為功能性納米顆粒和細胞膜涂層，通過攜帶有化療藥物、基因藥物的功能性納米顆粒發揮藥效，細胞膜涂層有紅細胞、白細胞等，起到遞送、保護和靶向作用。雖然仿生納米顆粒載體具有諸多優勢，但其制備技術不完善，潛在毒性研究不全面，仍需對其進行全面的安全性評估。

聚合物納米顆粒載體的構成結構為陽離子聚合物、樹枝狀聚合物或多糖聚合物，具有生物相容性好、可降解等特點。mRNA分子在靜電吸引和疏水相互作用的幫助下與陽離子聚合物形成較為穩定的多聚體[29]。仿生納米顆粒具有較好的生物相容性，較低的免疫原性，作為mRNA藥物遞送載體極具潛力，但其制備工藝復雜，應充分考慮其潛在的不良反應。

2mRNA藥物載體臨床前評價研究

對于mRNA藥物載體的臨床前安全性評估應充分考慮其在生物體內的分布、組織器官的蓄積以及對免疫系統的影響。

2.1 生物分布

mRNA藥物載體的生物分布研究是評估藥物安全性的重要環節，對于探究其對不同組織、器官的影響有著重要的意義。常用的生物分布研究技術有熒光素酶標記法、同位素標記法、定量聚合酶鏈反應(qPCR)和分支鏈DNA信號放大技術(bDNA)。熒光素酶標記法通過將編碼熒光素酶的LNP注射入小鼠體內，通過活體成像技術可以實時監測其在小鼠內的分布過程。BioNTech公司/Pfizer公司研發的新冠病毒疫苗BNT162b2采用活體成像法檢測mRNA在體內的分布，通過將包裹熒光素酶mRNA的LNP注射入小鼠體內進行生物分布研究，給藥后6h在注射部位和肝臟中均檢測到熒光，48h后肝臟中無法檢測到熒光表達。LNP常通過同位素標記法進行體內分布研究，采用放射性[3H]標記LNP，該脂質標記物不會和細胞脂質交換，也不會被代謝。疫苗BNT162b2的LNP通過同位素試驗進行分布檢測，研究發現給藥后在注射部位、血漿和大部分組織內均可檢測到放射性，主要分布在肝臟、腎上腺、脾臟和卵巢。分支鏈DNA信號放大技術也是評估藥物在體內分布的重要工具，取給藥后小鼠各組織器官，采用bDNA法檢測mRNA藥物的含量，與活體成像技術相結合能夠較為全面地分析藥物在各組織器官的含量。Moderna公司研發的新冠病毒疫苗mRNA-1273采用bDNA法進行生物分布研究，給藥后2h在大鼠的腦、心臟、肺臟、眼球、睪丸等組織均檢測到了mRNA分布。

2.2 免疫原性和免疫毒性

mRNA藥物載體的免疫原性是其安全性評價中的另一個關鍵因素。由于mRNA藥物載體中陽離子脂質和PEG化脂質具有免疫原性，能夠引起細胞免疫與體液免疫，過強的免疫反應可能會產生免疫毒性，因此對其進行免疫原性的評估對于預測免疫相關不良反應有著重要的作用。常用的檢測藥物免疫原性的試驗有抗藥抗體檢測、血液T細胞淋巴亞群分布等。常用的試驗技術為酶聯免疫吸附試驗(Elisa)、流式細胞術。Nicolas Vabret團隊采用流式細胞術評估T細胞免疫效應，研究人員在接種mRNA疫苗小鼠的外周血和脾臟樣本中檢測到了CD8+T細胞，表明了該疫苗能夠誘導T細胞免疫應答[30]。

2.3 一般毒性

mRNA藥物的一般毒性檢查主要為重復給藥毒性實驗。試驗檢查項目包含臨床癥狀觀察、注射部位觀察、體重、攝食量、眼科學、血液學、尿液分析、凝血功能、組織病理學檢測等，對于非人靈長類動物還可檢測其體溫、血壓、心電圖等指標。疫苗BNT162b2的臨床前安全性評估研究中[31]，試驗采取重復給藥的方式，每周給雄性和雌性Wistar Han大鼠肌肉注射疫苗1次，共3劑，劑量設置為30和100μg。該研究檢測了體重、體溫、注射部位、視力、聽覺、血液學、凝血功能等指標，研究發現接種疫苗后24h內大鼠平均體重較輕，恢復階段對體重無明顯影響; 給藥后4和24h大鼠的體溫較高; 注射部位可觀察到局部反應，出現輕微的紅斑與水腫，且呈劑量依賴性; 血液學檢測結果顯示白細胞升高，包含中性粒細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞; 組織病理學結果顯示脾臟重量增加、其余器官無明顯變化。Ndeupen等[32]研究表明，肌肉注射mRNA藥物會導致注射部位產生局部炎癥如水腫及紅斑，該不良反應主要為LNP中陽離子脂質固有炎癥特性導致。當mRNA藥物進入循環系統遞送至全身時會產生各種不良反應，最為常見的是疼痛、腫脹、發熱，這些不良反應主要是由IL-1β和IL-6等促炎細胞因子介導的炎癥級聯反應。因此，在其他種屬動物體內進行陽離子脂質的促炎作用研究，深入解析其促炎作用通路，對LNP載體優化、推動藥物臨床轉化具有重要指導意義。

3結語

目前，mRNA藥物在應對突發性傳染性疾病、治療腫瘤等領域取得了重大進展，展現出極高的發展和應用潛力。相較于傳統藥物，mRNA藥物的核心優勢在于研發周期短，能夠迅速應對新型病原體; 藥物安全性較高，不會整合進入基因，通過在細胞質內合成功能蛋白發揮療效。但mRNA藥物仍存在安全性風險，特別是mRNA藥物遞送系統中的成分，如PEGs、陽離子脂質、無機離子等，可能會導致炎癥、肝腎損傷、過敏等不良反應。尚未有全面、系統和公認的mRNA藥物的評價技術體系，現有的評價技術和方法不能夠準確反映mRNA藥物在體內的真實情況，對于藥物的分布、代謝、潛在毒性效應等關鍵信息需要進行進一步挖掘。相信隨著科學技術的不斷進步和對mRNA藥物載體毒性機制研究的深入，未來將構建出一套科學系統的評價體系，實現對mRNA藥物進行全面的安全性評估，推動mRNA藥物臨床轉化應用。