蛋白質免疫印跡法是基于蛋白質SDS-PAGE電泳分離和特異性抗體識別蛋白的特性，通過顯色技術，以達到檢測目的蛋白的技術。該技術廣泛應用于定性檢測蛋白水平的表達，活性分析與鑒定。

該實驗步驟多，關鍵點多，耗時長，每個步驟可能都影響最終的結果，所以實驗中經常出現各種問題。筆者根據個人實際實驗操作中遇到的問題將從WB的配膠和電泳階段分析問題原因或給出解決方法。

一、配膠階段注意事項

配膠試劑管理：

應確保所使用的配膠試劑在有效期內，且試劑需清澈透明。若發現有沉淀或結晶產生，應及時進行更換。

2. pH 8.8的Tris-HCl和pH 6.8的Tris-HCl可能會出現沉淀，因此需根據需要選擇合適的濃度（1.0M或1.5M）。同時，10%的SDS在低溫（4℃以下）存放時容易結晶，而30%的丙烯酰胺則需要在避光且低溫（4℃以下）的條件下保存。

APS（過硫酸銨）活性較強，室溫下容易失效，建議進行分裝后冷凍保存于-20℃。由于TEMED（四甲基乙二胺）揮發性強且有毒，因此需要在通風條件良好的環境下使用，避免長時間直接暴露在空氣中。

操作技巧：

1. 在插入梳子時，應采用斜插的方式，以有效避免氣泡的產生。

2. 為了防止膠條老化和干燥，電泳結束后，應將膠條置于實驗臺上晾干。如果膠條出現裂紋，可以使用保鮮膜進行覆蓋，這樣不僅可以防止膠液泄漏，還能延緩膠條的老化。

3. 最佳的操作方法是現配現用膠。如果需要保存，可以使用濕潤的保鮮膜將膠包好，并放置在4℃的冰箱中。

常見問題分析：

1.漏膠問題：

原因分析：漏膠通常由于玻璃板未對齊、底部缺損、厚玻璃板邊條密閉性不佳或塑料夾子過松所導致。

解決方法：在操作前，務必確保玻璃板干燥，以防潮濕影響對齊。在對齊玻璃板時，應使用一手的食指按壓厚玻璃板的一側上緣，同時用拇指按壓薄玻璃板的同側上緣，然后同時向下按壓并鎖定該側的鎖扣。接著，重復此步驟以鎖定另一側，確保玻璃板緊密對齊。

2.膠體未凝固：

原因分析：膠體未能凝固可能是由于APS或TEMED失效，或者在膠體未完全凝固時對其進行了移動。

解決方法：在制備膠體前，確認所有試劑的有效性，并嚴格按照正確的配比進行混合。如果配比無誤但膠體仍未凝固，可以嘗試增加凝固劑的用量或延長凝固時間。

3.膠體中存在氣泡：

情況一：膠底部出現氣泡，可能是膠墊材質或梳子插入不當所致?？筛挠脤嵭能浤z墊或添加保鮮膜。

情況二：梳子下緣出現氣泡，解決方法是先插入一側梳子再插另一側。

4.拔梳子后泳道有膠絲：

原因分析：此問題通常是由于TEMED用量過多，導致膠體凝固過快。

解決方法：在制備膠體時，適當減少TEMED的用量。

5.拔梳子后泳道歪斜：

原因分析：泳道歪斜往往是由于梳子與玻璃板不匹配所致。

解決方法：在灌膠之前，務必先測試梳子與玻璃板的匹配度，確保它們能夠緊密貼合。

二、電泳階段注意事項

電泳操作要點：

1.確保上樣一致性：

在進行上樣時，必須確保每個加樣孔的上樣體積保持一致，這樣可以避免蛋白條帶出現水平不齊的情況。對于空置的加樣孔，需要添加與樣品等體積的1×loading buffer，以防止相鄰通道的蛋白樣品發生擴散。同時，上樣時應緩慢添加樣品，避免快速吹打導致樣品溢出，且上樣體積應控制在加樣孔總容積之內。

2.電泳液的使用：

內槽需要被電泳液填滿，而外槽則只需填至1/4處。對于不同厚度的玻璃板，上樣量也有所不同。例如，1.0mm厚的玻璃板每孔最多可以上樣20μL，而1.5mm厚的玻璃板每孔則可以上樣40μL。

3.合理設置電壓：

電壓的設置需要根據環境溫度來調整。在夏季室溫較高時，應適當降低電壓；而在冬季則可以提高電壓。分離膠的固定電壓應設為150V。在調節電壓時間時，可以參考marker的位置。當marker分開時，表示蛋白已經進入分離膠。此外，在夏季高溫時，可以將電泳槽放入冰水中進行降溫，以防止凝膠發生變形。

4.常見問題分析：

1）電泳帶扭曲或歪斜：

原因分析：這種情況通常是由于電泳液未加足夠或發生漏液所導致。

解決方法：在電泳過程中，要及時檢查和補充電泳液，以確保電泳槽內的液體保持足夠的量，從而逐漸糾正電泳帶的走向。

2）電泳帶出現拖尾現象：

原因分析：拖尾現象往往是因為樣本未能充分溶解。

解決方法：在進行上樣前，務必確保樣本已經完全溶解，這樣可以有效減少拖尾現象的發生。

3）電泳帶向兩側過度擴散：

原因分析：擴散過度通常是由于上樣量過多所引起。

解決方法：應當適當減少上樣量，以控制電泳帶的擴散范圍，保持電泳帶的清晰度。

4）溴酚藍呈笑臉狀：

原因分析：當制膠試劑溫度過高或制膠后未能及時保濕時，可能導致膠層不均勻，從而使得溴酚藍呈現特殊的笑臉形狀。

解決方法：在進行電泳時，應降低電壓并調節電泳速度，同時確保電泳過程在冰浴條件下進行，以減少膠層不均勻的情況。

5）電泳條帶不整齊：

原因分析：條帶不整齊可能由于膠凝固不均勻、膠的下邊緣存在氣泡、上樣buffer濃度不準確或在拔梳子時操作不當所導致。

解決方法：應等待膠完全凝固后再進行上樣，以確保實驗結果的最佳性；電泳前需仔細檢查并清除膠底部的氣泡；重新配置適宜濃度的上樣buffer；在拔梳子時，應水平且緩慢地進行，以確保樣品孔的均勻性。

6）電泳條帶過粗：

原因分析：條帶過粗可能是由于上樣量過大、濃縮膠未能有效濃縮、濃縮膠的pH值不準確或電壓過高所導致。

解決方法：應適量減少上樣量；考慮增加濃縮膠的長度以提高濃縮效果；確保濃縮膠的pH值調整至正確的6.8；同時，適當降低電泳的電壓。

通過嚴格遵守上述電泳階段的注意事項，并不斷優化實驗流程，可以有效提升Western Blot實驗的成功率，并確保實驗數據的準確性和可靠性。