在蛋白質組學及分子生物學研究中，凝膠電泳技術（如SDS-PAGE電泳）因其高分辨率分離能力，已成為解析復雜蛋白質混合物、評估分子量分布及翻譯后修飾的核心技術。

凝膠電泳后的染色步驟是實驗中至關重要的一環，通過與蛋白質的特異性結合，使電泳分離后的蛋白質條帶得以顯現出來，為后續的定性、定量分析以及質譜鑒定奠定基礎。染色方法有很多種，下面為你介紹實驗室常用的幾種染色方法。

圖片來源：https://www.khanacademy.org/test-prep/mcat/biomolecules/x04f6bc56:protein-analysis-techniques/a/protein-electrophoresis-and-sds-page

一、考馬斯亮藍染色（Coomassie Brilliant Blue, CBB）

考馬斯亮藍染色是一種經典的蛋白質染色方法，適用于聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）后的蛋白質檢測。考馬斯亮藍（Coomassie Brilliant Blue）是一種酸性三苯甲烷染料，通過靜電作用與蛋白質的堿性基團（如氨基、胍基）結合，同時通過疏水作用與蛋白質的疏水區域相互作用，形成藍色復合物。

這種復合物在可見光下呈現深藍色條帶，從而實現蛋白質的可視化檢測。這種方法靈敏度較高，可以檢測到約0.1μg的蛋白質，且背景染色低，易于操作。

圖片來源：https://doi.org/10.1371/journal.pone.0056168.g001

目前廣泛用的考馬斯亮藍有G-250和R-250兩種，G-250含三個磺酸基團和兩個甲基，在酸性溶液中呈藍偏綠色，與蛋白質通過疏水作用結合，形成深藍色復合物，但脫色困難；R-250比G-250少兩個甲基且磺酸基團較少，呈藍色帶紅色調，通過靜電和疏水雙重作用緩慢結合，染色后可通過有機溶劑洗脫，操作成本低但耗時較長。G-250質譜兼容性更優，而R-250適合常規染色及長期保存。

二、  銀染（Silver Staining）

銀染法是一種基于金屬銀沉積顯色的蛋白質檢測技術，靈敏度可達0.1-1 ng/條帶，比考馬斯亮藍染色高100-1000倍。

銀染法的顯色過程分為兩個關鍵階段：

1、銀離子結合：

銀離子（Ag?）通過靜電作用與蛋白質的羧基（-COOH）、氨基（-NH?）及硫醇基（-SH）結合，形成"蛋白質-銀"復合物。

2、銀離子還原：

在還原劑（如甲醛、硼氫化鈉或硫代硫酸鈉）的作用下，銀離子（Ag?）被還原為金屬銀（Ag?），金屬銀在蛋白質表面沉積，形成可見的黑色或棕色條帶，顯色強度與蛋白含量正相關。

雖然銀染法的靈敏度遠高于考馬斯亮藍染色，但其操作步驟較為復雜，且甲醛的使用讓凝膠中蛋白化學交聯，導致質譜不兼容；線性范圍窄，不太適合量化；核酸、脂類、糖脂類化合物常會對銀染染色的結果進行干擾，導致實驗重復率低。

圖片來源：https://www.licorbio.com/applications/colorimetric-and-fluorescent-gel-staining

三、負染（Negative Staining）

負染法是一種通過選擇性沉淀金屬離子于凝膠背景，使蛋白質條帶保持透明的快速檢測技術。其核心是反向顯影（背景染色，蛋白透明），負染液中的金屬離子（如鋅、銅、鎳等）在凝膠的非蛋白區域（聚丙烯酰胺基質）形成不溶性鹽沉淀，產生深色背景。蛋白質條帶因表面電荷或化學特性阻礙金屬鹽沉積，保持透明或淺色，與深色背景形成對比。

常用方法包括咪唑鋅法和氯化銅法，以咪唑鋅為例，鋅離子通過配位作用與咪唑結合，形成復合物沉淀于凝膠基質；蛋白質條帶因缺少結合位點保持透明。染色后可通過EDTA或磷酸緩沖液洗脫金屬離子，恢復蛋白質活性。

圖片來源：https://www.nacalai.com/global/Download/pdf/Gel_Negative_Stain_Kit.pdf

負染法的優點是快速、低成本、不破壞蛋白質活性；缺點是對比度較差，且重現性受到諸多物理化學因素的影響(例如染色液的pH，膠中陰離子的濃度、溫度等)，因此限制本方法的廣泛使用。

四、熒光染色（Fluorescent Staining）

熒光染色是一種基于熒光染料特異性標記蛋白質的高靈敏度檢測技術，該方法靈敏度可達納克級（如SYPRO Ruby靈敏度可達1-10 ng/條帶）。其核心原理是通過熒光分子與蛋白質結合后，在特定波長光激發下發射熒光信號，從而實現可視化檢測。

圖片來源：https://www.researchgate.net/publication/323999097_Fluorogenic_Ag-Tetrazolate_Aggregation_Enables_Novel_and_Efficient_Fluorescent_Biological_Silver_Staining

常見的熒光染料如SYPRO Ruby和Deep Purple，它們與蛋白質的結合方式可能不同，有的是通過疏水相互作用，有的可能涉及靜電作用或其他機制。

● 疏水作用主導型（如SYPRO Ruby、Deep Purple）：染料通過疏水作用嵌入SDS包裹的蛋白質疏水區域，而非依賴靜電結合。這種結合方式無需對蛋白質進行共價修飾，因此不會干擾蛋白質的結構和功能。

● 靜電作用主導型（如Nile Red、Epicocconone）：在非變性電泳中，染料通過靜電作用結合蛋白質表面帶電基團（如氨基、羧基）適用于Native-PAGE或特定修飾蛋白檢測。

● 共價結合型（如FITC、Cy系列染料）：通過化學反應（如與氨基共價結合）標記蛋白質，與疏水或靜電作用型染料不同，共價結合型染料需要在電泳前，即蛋白質樣品制備階段，就與蛋白質發生反應。

以上就是蛋白質凝膠常見的幾種染色方法，在實際應用中，我們需要根據實驗目的、蛋白質豐度、后續分析需求以及實驗條件等因素，綜合考慮各種染色方法的優缺點，選擇最合適的染色方案，以確保實驗結果的準確性和可靠性。