靶蛋白降解（Targeted protein degraders, TPDs）是一種比較新的小分子藥物形式，利用體內泛素蛋白酶系統（ubiquitin proteasome system, UPS）對目標蛋白進行降解。目前進展較快的TPDs處于臨床Ⅲ，是一款名為ARV-471的雌激素受體降解劑。
TPDs分子的形式如下圖所示，由三部分組成：識別靶蛋白的配體、連接子和識別E3連接酶的配體。PROTAC是TPDs常見形式。PROTAC分子通過結合靶蛋白（POI）和E3連接酶，形成三元復合物，給靶蛋白打上泛素化的標簽，泛素化的蛋白被細胞內的蛋白酶體26S識別并降解。
TPDs是典型的不符合Lipinski's Rule of 5即類藥五原則的分子（比如分子量<500，不超過5對氫鍵供體，不超過10對氫鍵受體，logP不超過5），再加上結構也較傳統化藥復雜，有點類似雙靶點小分子，在非臨床安評部分有諸多需要特別關注的點。目前還沒有針對TPDs非臨床研究的專有指南，這類領域也尚無產品上市，可參考的權威資料有限。
找到一篇來自Pfizer、BMS、Abbvie、Astrazeneca和GSK的團隊，就TPDs非臨床安全性評價，做的一個調查問卷。文章名：《Industry perspective on the nonclinical safety assessment of heterobifunctional degraders》，感興趣的也可以自行檢索。文中，對TPDs非臨床安評的一些特殊之處或需要重點關注之處給出了提示，結合筆者的一些理解，從體外和體內安全性角度略作分享。
體外安全性
TPDs類產品體外安全性與常規小分子化藥要求類似。但TPDs也有一定特殊性，或者說需要特別關注的點。
比如TPDs普遍溶解度不好，需要關注毒性評估是否會受限于溶解度差。
另外，需額外關注非特異性結合及可能引起的脫靶毒性。關于脫靶毒性，傳統小分子通常會開展受體譜、激酶譜的研究，以確定藥物可能影響的信號通路，或可能導致的次要藥理學作用。TPDs類產品則不同，由于這類產品靶蛋白端結合什么，就可能降解什么，因此需要對各種蛋白的濃度進行監測，以確定是否出現可能脫靶降解。關于蛋白脫靶，也不能像小分子似的，選擇一組常見的受體或者酶進行篩選。TPDs需要對大量的已知和未知的蛋白質進行廣泛評估，該文章推薦的關鍵技術是蛋白質組學研究。蛋白質組學技術其實在科研院所用的比較多，是從整體的角度，分析細胞（或組織等）內動態變化的蛋白質組成成份、表達水平與修飾狀態，能更全面的評估可能的在靶或脫靶蛋白變化。如下圖所示，一個靶向AR受體的PROTAC候選分子ARD-2051，采用蛋白質組學技術在VCaP細胞系中，對>5700蛋白質進行了分析，以評估ARD-2051的選擇性，選擇DMSO處理的細胞作為對照，結果顯示ARD-2051在0.1、1μM濃度可以將AR蛋白水平降低82%以上，且AR是唯一濃度降低超過2倍的蛋白，說明ARD-2051的選擇性還不錯，沒有明顯的脫靶。
TPDs的作用持續時間也是一個關注點。TPDs只需要比較低的濃度即可發揮作用，而且E3連接酶-TPD-靶蛋白三元復合物降解完一個目標蛋白后，還可繼續降解下一蛋白，循環利用，作用時間持久。這是和小分子化藥比較大的一個區別。
此外，TPDs類產品通常滲透性一般，但又需要穿過細胞膜進入胞內才能發揮作用，故約47%的TPDs開發企業會對產品的滲透性進行重點評估。
體內安全性
TPDs類產品體內安全性所遵循的指南和要求與常規小分子化藥要求類似。需要特別關注點的包括種屬選擇、給藥頻率、恢復期、脫靶毒性及胚胎-胎仔發育毒性的早期評價。
TPDs類產品的理化性質一般，故供試品方面遇到比較大的挑戰還是溶解度問題。溶解度又通常與暴露量有相關性。但目前還沒有太好的策略從制劑層面解決這一問題。常用的制劑處方還是pH調節劑、環糊精、表面活性劑和脂質成分等。
給藥途徑方面，大部分企業選擇PO和IV給藥。而SC給藥出現給藥部位耐受性問題的概率比其他途徑更高。
幾乎90%的受訪企業反饋，TPDs類產品體內毒理研究中的毒性表現會出現非on-target情況。而且并不認為是E3泛素酶降解所致，所以也不能定性為脫靶，具體機制不明。不同公司不同TPD產品的毒性累及器官也不一樣，未發現共性特點。唯一能做的就是默認非on-target毒性具備臨床相關性，做好風險管理計劃。也有受訪企業通過調整給藥途徑解決該問題，但具體技術細節并未披露。
給藥頻率通常可通過PK/PD研究確定。單純PK參數不能作為給藥頻率制定的唯一依據。相反，TPDs產品的PK/PD數據通常還會出現背離。究其原因，PK通常僅檢測外周血血藥濃度，當外周血濃度低于LLOQ時，組織中即使較低濃度的TPDs依然還在持續發揮作用（PROTACs may enable a disconnect between pharmacokinetics and pharmacodynamics to provide extended duration of in vivo efficacy long after the PROTAC has been cleared from systemic circulation）。所以，可以結合PK和組織中靶蛋白降解情況確定給藥頻率。
恢復期設置也要考慮到TPDs產品藥理作用的延遲和延長。
種屬選擇對任何形式的藥物安評都至關重要，TPDs類產品自然也不例外。TPDs的種屬選擇基本原則是在目標種屬中具備藥理學活性。比較特別之處在于TPDs是雙靶，既要結合目標降解蛋白，還要考慮E3泛素酶配體與E3泛素酶如CRBN之間的種屬差異。另外，鑒于脫靶是TPDs繞不開的風險，種屬選擇還要將種屬間脫靶相似性作為依據之一。這里不得不再次提到蛋白質組學，通過不同種屬細胞的蛋白質組學研究，找到與TPDs在人體細胞中降解蛋白類似的種屬，既考察目標靶蛋白，也兼顧潛在的脫靶蛋白（Building confidence in species selection is a key activity for the safety evaluation of TPDs. Degradation of on-and off-target proteins also needs to be adequately assessed using proteomic techniques）。另外，如果選擇CRBN E3泛素酶，非人靈長類并不是非嚙齒類動物的默認選擇（Importantly, there was a unanimous response that companies do not default to nonhuman primates as the nonrodent species for toxicity studies when the E3 ligase is CRBN）。當然，這點主要是與CRBN目前是大多數TPDs開發企業的主要選擇，公開發表的CRBN種屬差異文獻較多有關。其它E3泛素酶雖然披露的數據少，但可能也會存在同樣的問題。不過，如果單從序列一致性看，人和食蟹猴的CRBN氨基酸相似度高達99.8%，442個氨基酸中，僅在第128為氨基酸有區別，該位點還不一定是配體的結合位點。但無論如何，這也是Pfizer、BMS、Abbvie、Astrazeneca和GSK等大廠調查問卷拿到的國外蛋白降解藥物開發企業給出的經驗之談。TPDs類產品的種屬選擇總體來看比較復雜，個人覺得核心原因與決定這類產品雙功能特性的是連接子兩端的兩段小分子，而小分子我們知道比較大的一個缺點就是特異性不好，所以無論結合靶蛋白端的小分子，還是結合E3泛素酶的配體小分子，多個變量將種屬選擇復雜化了。所以，TPDs的很多毒性表現機制尚不明確。文中推薦的蛋白質組學或許是一種簡單直接的做法，無論中間在靶或脫靶結合哪些蛋白，最終還是要看結果，大范圍的蛋白質變化監測其實很大程度上提高了成功的概率。當然，難點也留給了蛋白質組學，主要體現在方法的可靠性、穩定性及結果的客觀性、全面性等。當然，類似小分子，體外代謝角度的研究如MetID對種屬選擇也是有必要的。
生殖毒性方面，大多數受訪企業均將胚胎-胎仔發育毒性試驗的開展節點前置了。這點與著名的致畸藥物沙利度胺不無關系。因為，CRBN的一個主要配體就是沙利度胺。很多選用CRBN的TPDs里面均含有沙利度胺的結構，如下圖所示。所以，無論擬開發適應癥是腫瘤還是非腫瘤，這一重大風險均需要引起足夠重視，盡早且全面評估。
安全藥理方面，TPDs的半衰期比化藥要久，比如ARVIVAS的ARV-471，動物中的消除半衰期達28h左右。但TPDs產品的另外一個特點是，延遲的、延長的持續降解，哪怕外周血已經檢測不到藥物存在，藥理作用依然在組織中默默持續。所以，通常的做法是延長給藥后的觀測時間。
不同開發階段TPDs的安評關注點如下圖所示。前文已有提及，不再贅述。
總結
TPDs類藥物安評基本原則跟化藥類似，但又有其特殊考量點。首先，TPDs理化性質不符合類藥五原則，溶解度和滲透性通常比較一般，涉及到藥物暴露和給藥途徑調整問題。其次，TPDs作用時間通常較化藥更久，且出現PK/PD的背離，需要延長體外、體內研究的觀測時間。比如恢復期的延長、安全藥理觀察時間的延長、細胞活性實驗監測時間的延長等。然后，脫靶毒性是TPDs產品常見問題之一，最好在PCC確定前即開展脫靶風險評估，蛋白質組學技術可以作為重點考慮。第四，TPDs作為雙功能小分子，種屬選擇既要參考化藥的代謝相關思路，更要兼顧在靶和脫靶的種屬間差異。關于這點，蛋白質組學的價值再被提及。另外，非人靈長類并不一定是默認的最佳選擇。最后，生殖發育毒性不一定到臨床階段評估，考慮到TPDs類產品的致畸高風險，通常將發育毒性開展節點前置。
TPDs產品屬于比較新穎的小分子藥物形式，尚無產品上市，國際和國內的經驗都不是太多，非臨床安評可以參考化藥相關指南，同時又要兼顧其結構、理化性質、藥理作用等的特殊性，特別關注一些屬于這類產品的特點，合理調整研究內容和試驗方案。
