目前在抗體類藥物的生產過程中，純化工藝有著非常重要的位置。從項目開始到抗體藥上市對于純化而言需要經歷多個階段，例如工藝開發，工藝放大與確認，IND臨床樣品生產，PC研究， PPQ以及商業化生產等，隨著工藝不斷的向前推進，實際上也是生產規模的一次次的放大，在放大的過程中往往伴隨一些條件的變化，比如柱子直徑的變化，容器類型的變化，樣品放置時間的變化等等，這些變化會偶爾導致出現此前未出現的一些小概率事件，從而導致放大失敗甚至是生產失敗，以下列舉了一些小概率事件。
1、 二硫鍵還原
近年來，隨著高濃度哺乳動物細胞培養技術的發展，抗體鏈間二硫鍵還原現象變得更為常見，主要是受到硫氧還蛋白與硫氧還蛋白還原酶的影響。為了控制這種現象，下游有多種策略可供選擇，如保持收獲液通氣操作，降低細胞收獲液溫度，縮短細胞收獲液保存時間以及對深層過濾壓力進行控制等，除此之外，有文獻提到加入過氧化氫來抑制還原現象的產生。更有意思的是，也有研究表明，即使在收獲期間抗體被還原，也可以在親和捕獲淋洗階段經過氧化還原緩沖液的沖洗，被還原的抗體能夠重新氧化為完整抗體。在圖1中 Batch2保持收獲液空氣/氧氣的操作，Batch1收獲液沒有通入任何氣體，結果顯示，Batch1在親和收獲后完整抗體比例很低，雖然后續層析步驟有所提升，但依然純度不高；而Batch2在整個工藝過程中都能保持較高比例的完整抗體。圖2中可以看到在親和純化過程中加入Wash2 氧化還原緩沖液淋洗步驟，可以將5%完整比例的抗體直接提升至93%的比例。然后通過Wash3緩沖液的沖洗來替換掉Wash2氧化還原劑組分，也不會影響后續的洗脫液。
而本文作者認為二硫鍵還原最大的痛點并不在于二硫鍵還原現象本身，因為現在已有許多措施能夠解決此類問題。而真正的痛點在于在某些項目中二硫鍵還原只發生在放大以及生產階段，甚至有些在生產階段只出現親和層析的第二個或后面幾個循環中，然而在小試開發階段并不會出現此現象，因此在確認工藝中并不會有抑制二硫鍵還原的措施。而小試與生產的差異原因推測可能是由于小試階段樣品的儲存容器主要為開口瓶或開口袋子，其中的收獲液可以與空氣接觸，而往往在生產階段收獲液主要保存于封口的儲液袋中，處于無氧狀態中，所以導致只在生產階段出現二硫鍵還原現象，對此本公司也有徹底的解決辦法。
圖1
圖2
2、 陽離子洗脫峰雙峰現象
陽離子的洗脫峰偶爾會出現雙峰現象，這種現象并不是由于分辨高能夠分離兩種不同的組分，因為將兩個峰的任一峰組分重新上柱且保持同樣的純化條件，依然會再次出現雙峰現象。將兩個峰進行純度檢測，我們會發現兩個峰純度是比較一致的。有文獻研究表明，雙峰現象出現的原因可能是填料結構，沖洗或洗脫條件的差異所導致，也有研究表明，雙峰現象根本原因是蛋白質構象發生了改變。無論原因為何，雙峰現象都可以通過優化填料種類，淋洗條件以及洗脫條件等得到解決。然而雙峰現象的真正的麻煩并不在于此現象本身，而是在有些案例中小尺寸的柱子洗脫峰并不能出現雙峰現象，而是會在更大尺寸或是生產規模的尺寸上才能展現出來，嚴重一些會導致生產收峰失敗從而導致當批次生產失敗。圖3中比較了6款填料，其中Fractogel SO3，Eshmuno S，Nuvia S和POROS 50HS出現了明顯的雙峰，Source 30S和UNOsphere rapid S則不明顯。在圖4中可以看到鹽濃度不同，洗脫pH不同雙峰分布也不同，表明通過優化洗脫條件也可以抑制雙峰現象。在圖5中可以看到柱直徑為1.1cm的時候出現雙峰現象（0.5cm柱子上未出現，未展示），當改變淋洗條件后雙峰消失，只剩唯一的洗脫峰。
圖3
圖4
圖5
3、 填料批次導致的收率大幅下降
在絕大多數的案例中填料批次往往并不是工藝關鍵參數，但是在極少數案例中，填料批次會極大影響工藝屬性表現。這就導致在小試階段工藝表現正常，而在放大或生產階段工藝表現異常。在表一中可以看到，Lot2的親和填料在兩個項目中的收率遠低于其它批次（質量無差異），所以批次的差異也需要在工藝開發中引起我們的注意。
表1 不同批次親和填料在不同項目中的表現
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Project
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Resin
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Elution
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Conc.
(g/L)
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Volume
(mL)
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Yield
(%)
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Project A
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Lot 1
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31.775
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7.507
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96.5
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Lot2
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15.783
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13.175
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82.7
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Lot 3
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26.155
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9.214
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96.4
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Lot4
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25.254
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9.42
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97.4
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Project B
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Lot 1
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36.058
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7.576
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89.3
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Lot2
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21.652
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10.548
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73.4
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Lot 3
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28.245
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9.658
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88.1
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Lot4
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29.584
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9.26
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90.6
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4、 總結
無論是二硫鍵還原、洗脫雙峰現象還是填批次導致的收率差異，往往發生于放大與生產過程中，不容易在小試階段被發現，同時這些都是小概率事件，很容易被工藝開發人員忽視。所以有必要在某些情況下建立相應的工藝開發策略，以應對這些小概率事件。
參考文獻
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