新型冠狀病毒（2019-nCoV）屬于β屬冠狀病毒，有包膜，顆粒呈圓形或橢圓形，直徑約為60~140nm。具有5個必需基因，分別針對核蛋白（N）、病毒包膜（E）、基質蛋白（M）和刺突蛋白（S）4種結構蛋白及RNA依賴性的RNA聚合酶（RdRp）。核蛋白（N）包裹RNA基因組構成核衣殼，外面圍繞著病毒包膜（E）,病毒包膜包埋有基質蛋白（M）和刺突蛋白（S）等蛋白。
實驗室檢查包括一般檢查，病原學及血清學檢查，胸部影像學檢查等。病原學檢查又包括核酸檢測和抗原檢測。核酸檢測主要采用逆轉錄PCR，二代測序等方法，在鼻、口咽拭子、痰液和其他下呼吸道分泌物等標本中均可檢測出新型冠狀病毒核酸。
新型冠狀病毒在流行過程中基因組不斷發生變異，新的變異株可能在傳播力、致病性、免疫逃逸能力等方面發生改變。變異株可能影響檢測試劑的性能，甚至出現漏檢。
本文適用于采用逆轉錄實時熒光 PCR法，對咽拭子、鼻咽拭子、肺泡灌洗液或痰液等呼吸道樣本中的新型冠狀病毒(2019-nCoV )核酸進行體外定性的檢測試劑。
根據《體外診斷試劑分類規則》，該產品按照第三類體外診斷試劑管理，分類編碼為6840。
一. 新型冠狀病毒（2019-nCoV）核酸檢測試劑性能研究實驗要求
1. 分析性能研究
開發人應采用在符合質量管理體系的環境下生產的試劑盒進行所有分析性能研究，確定具體研究方法、試驗方案、試驗數據、統計分析等。
如產品適用不同的機型，需要對采用不同機型進行性能評估。如申報產品包含不同的包裝規格，需要對各包裝規格進行分析或驗證。
適用的不同樣本類型應分別進行分析性能研究。
1.1樣本穩定性
考慮到病毒RNA極易被降解的特性，應對樣本穩定性進行詳細研究，包括采集后未經處理的樣本，加入不同裂解液/消化液的樣本，滅活處理后的樣本，研究內容包括冷藏保存時間，冷凍保存時間，凍融次數等。
如產品適用拭子、痰液等不同的樣本類型，因其中干擾物質存在較大差異，可能對病毒RNA降解的影響不同，建議對每種樣本類型均進行穩定性研究。
如核酸提取液可不立即進行檢測，還需對核酸提取液的保存條件和穩定性進行研究。
1.2適用的樣本類型
明確產品適用的樣本類型。
1.3企業參考品驗證
根據主要原材料研究資料中的企業參考品設置情況，采用三批產品對企業參考品進行檢驗并提供詳細的試驗數據。
1.4精密度
應對精密度指標，如標準差或變異系數等的評價標準做出合理要求。應考慮運行、時間、操作者、儀器、試劑批次和地點等影響精密度的條件，設計合理的精密度試驗方案進行評價。精密度評價試驗應包含核酸提取步驟。設定合理的精密度評價周期，例如為期至少20天的檢測。對檢測數據進行統計分析，獲得重復性、實驗室內精密度、實驗室間精密度、批間精密度等結果。
采用臨床樣本進行精密度評價，應至少包含3個水平：陰性樣本、臨界陽性樣本、中/強陽性樣本，并根據產品特性設定適當的精密度要求，例如：
陰性樣本：待測物濃度低于檢出限或為零濃度，陰性檢出率應為100%（n≥20）。
臨界陽性樣本：待測物濃度略高于試劑盒的檢出限，陽性檢出率應≥95%（n≥20）。
中/強陽性樣本：待測物濃度呈中度到強陽性，陽性檢出率為100%且Ct值的CV≤5%（n≥20）。
1.5包容性
1.5.1病毒樣本的驗證
驗證具有時間和區域特征性的至少20個不同來源的陽性樣本（臨床樣本或病毒培養物），應包括檢出限和重復性的驗證。樣本應覆蓋目前國內流行的變異株型別，并適當納入其他代表性的變異株。注意包容性研究樣本和檢出限研究樣本不能重復。
1.5.2生物信息學分析及人工合成樣本的驗證
按照器審中心另行公布的變異株驗證相關要求進行評價。
1.6檢出限
1.6.1檢出限的確定
將不同來源的至少5個新冠病毒樣本梯度稀釋于與適用樣本一致的基質中，進行檢出限的確定。每個濃度梯度最少重復3次檢測，以100%可檢出的最低濃度水平作為估計檢出限，在此濃度附近制備若干梯度濃度樣本，每個濃度至少重復20次檢測，將具有95%陽性檢出率的最低濃度水平作為確定的檢出限。
1.6.2檢出限的驗證
選擇另外5個不同來源的新冠病毒樣本在檢出限濃度水平進行驗證，應達到95%陽性檢出率。
1.7分析特異性
1.7.1交叉反應
需驗證相關病原體和多例人類基因組DNA（表1）的交叉反應。除SARS冠狀病毒和MERS冠狀病毒可采用假病毒外，各病原體均應采用臨床樣本或培養物進行驗證。建議在病毒和細菌感染的醫學相關水平進行交叉反應的驗證。通常，細菌感染的濃度水平為106CFU/mL或更高，病毒為105PFU/mL或更高，明確所有用于交叉反應驗證的病原體樣本的來源、陰陽性、種屬/型別和濃度等。
表1 需進行交叉反應驗證的物質
|
地方性人類冠狀病毒（HKU1，OC43，NL63和229E）、SARS冠狀病毒、MERS冠狀病毒 |
|
H1N1（新型甲型H1N1流感病毒（2009）、季節性H1N1流感病毒、H3N2、H5N1、H7N9，乙型流感Yamagata、Victoria，呼吸道合胞病毒A、B型，副流感病毒1、2、3型，鼻病毒A、B、C組，腺病毒1、2、3、4、5、7、55型，腸道病毒A、B、C、D組，人偏肺病毒、EB病毒、麻疹病毒、人巨細胞病毒、輪狀病毒、諾如病毒、腮腺炎病毒、水痘-帶狀皰疹病毒 |
|
肺炎支原體、肺炎衣原體 |
|
軍團菌、百日咳桿菌、流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、化膿性鏈球菌、肺炎克雷伯菌、結核分枝桿菌 |
|
煙曲霉、白色念珠菌、光滑念珠菌、新生隱球菌等 |
|
高濃度人類基因組DNA |
1.7.2競爭性干擾
開發人應充分考慮臨床上容易與新冠病毒合并感染的病原體，在高濃度的情況下對低濃度（例如檢出限濃度）新冠病毒核酸檢測的影響，進行競爭性干擾研究。
1.7.3干擾試驗
應根據所采集樣本類型，針對可能存在的內源/外源物質干擾情況進行驗證。在每種干擾物質的潛在最大濃度（“最差條件”）條件下進行試驗，檢測包含臨界陽性水平在內的新冠病毒樣本。對結果進行合理的統計分析，對比添加干擾物質前后的 Ct 值差異。檢測的潛在干擾物包括樣本中的原有物質及在樣本采集和處理期間引入的物質。
表2 用于干擾試驗的物質
|
類別 |
具體物質 |
|
粘蛋白 |
|
血液（人類） |
|
鼻腔噴霧劑或滴鼻劑 |
苯福林、羥甲唑啉、氯化鈉（含防腐劑） |
|
鼻用皮膚類固醇 |
倍氯美松、地塞米松、氟尼縮松、曲安奈德、布地奈德、莫米松、氟替卡松 |
|
緩解咽部癥狀的藥物 |
相關含片、噴劑等 |
|
過敏性癥狀緩解藥物 |
鹽酸組胺 |
|
抗病毒藥物 |
α-干擾素、扎那米韋、利巴韋林、奧司他韋、帕拉米韋、洛匹那韋、利托那韋、阿比多爾 |
|
抗生素 |
左氧氟沙星、阿奇霉素、頭孢曲松、美羅培南 |
|
全身性抗菌藥物 |
妥布霉素 |
|
樣本采集和處理期間引入的物質 |
1.8核酸（RNA）提取/純化性能
在進行核酸檢測之前，建議有核酸（RNA）提取/純化步驟。該步驟的目的除最大量分離出目的RNA外，還應有相應的純化作用，盡可能去除PCR抑制物。對配合使用的所有核酸提取試劑進行提取核酸純度、濃度、提取效率的研究，并與質量較好的核酸提取試劑進行平行比對。若產品適用兩種或以上核酸提取試劑，則每一種核酸提取試劑均需配合檢測試劑進行抗干擾、精密度和檢出限的驗證。
1.9反應體系
1.9.1樣本采集和處理
1.9.1.1樣本采集方式的選擇
1.9.1.2樣本采集時間點的選擇：是否受病程、臨床癥狀、用藥情況等因素的影響。
1.9.1.3采樣拭子及樣本保存液的選擇：對拭子頭和拭子桿的材質要求。明確保存液或裂解液的成分、濃度、使用量的要求等。配套的不同保存液或裂解液需驗證檢出限和重復性。
1.9.1.4樣本處理方式的選擇：研究產品適用的滅活方式，包括熱滅活和化學滅活，研究內容包括胍鹽的使用濃度及用量、樣本用量。如適用，對痰液消化方式及消化液進行研究。
1.9.2核酸提取和反應體系
研究確定最佳核酸提取和反應體系，包括核酸提取用的樣本體積、洗脫體積和PCR加樣體積、各種酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽離子濃度及反應各階段溫度、時間、循環數等。建議在保證核酸提取質量的情況下盡量擴大總反應體系和加樣量，以提高檢測靈敏度。
反應體系研究應確保不同基因的檢測能力具有一致性，對于結果為單基因陽性時需要復測的試劑，需使用至少10例臨床樣本梯度稀釋，觀察各基因檢出情況是否存在顯著差異，避免過高的復測率。
確定不同適用機型基線和閾值循環數。
不同適用機型的反應條件如果有差異應分別進行驗證。
2. 穩定性研究
申報試劑的穩定性主要包括實時穩定性（有效期）、開瓶穩定性及凍融次數限制等研究，開發人可根據實際需要選擇合理的穩定性研究方案。對于實時穩定性研究，應對至少三批產品在實際儲存條件下保存至成品有效期后進行研究。
3. 陽性判斷值研究
陽性判斷值一般為申報產品檢測病毒核酸陽性的Ct值。陽性判斷值研究用樣本來源應具有多樣性和代表性，考慮不同時間、地域、不同的感染階段和生理狀態等因素，盡量納入較多弱陽性和高陰性水平的樣本。在條件允許的情況下，建議覆蓋目前的流行株進行陽性判斷值研究。采用ROC曲線分析建立每個檢測靶基因的陽性判斷值，然后確定產品的判讀規則（單基因陽性、雙基因陽性等）。對于結果為單基因陽性時需要復測的試劑，建議對陽性判斷值研究數據進行復測率的統計分析。如判定值存在灰區，對灰區進行確認。
如果產品適用不同樣本類型，需要對各樣本類型進行陽性判斷值的驗證。
研究確定內標檢測結果范圍。
4. 其他研究
4.1主要原材料研究
該類產品的主要原材料包括引物、探針、酶、dNTP、核酸分離/純化組分（如有）、質控品、參考品等。應確定主要原材料的選擇與來源、制備過程、質量控制標準等相關研究、質控品的定值試驗等。主要原材料可為企業自制也可源于外購。供應商應固定，不得隨意更換。
4.1.1引物和探針：應明確引物、探針核酸序列、靶序列的基因位點及兩者的對應情況。建議每種病毒設計兩套或多套引物、探針以供篩選，通過序列比對和功能性試驗等方式，對病毒進行包容性和特異性（如交叉反應）的評價，其中序列比對包括與已公布新冠病毒序列的比對，及與易產生交叉反應的其他病原體的序列比對；功能性試驗包括對不同來源、不同滴度的新冠病毒核酸陽性樣本，和不同的近緣病原體的檢測。通過篩選確定最佳的引物和探針組合。引物、探針的質量標準應至少包括序列準確性、純度、濃度及功能性實驗等。
4.1.2脫氧三磷酸核苷（dNTP）：包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP，應對其純度、濃度、功能性等進行驗證。
4.1.3酶：需要的酶主要包括DNA聚合酶、逆轉錄酶、尿嘧啶DNA糖基化酶等，應分別對酶活性、功能性等進行評價和驗證。
4.1.4質控品
試劑盒一般包含陰性質控品和陽性質控品。陽性質控品應包含試劑盒檢測的靶序列，可采用假病毒制備。質控品需參與樣本處理、核酸的平行提取和檢測的全過程，以對整個提取和PCR擴增過程、試劑/設備、交叉污染等環節進行合理質量控制。對質控品的檢測結果Ct值范圍做出明確的要求。
4.1.5內標
內標，又稱內對照，可對管內抑制導致的假陰性結果進行質量控制，應與靶核酸一同提取及擴增。開發人需對內標的引物、探針設計和相關反應體系的濃度做精確驗證，既要保證內標熒光通道呈明顯的陽性曲線又要盡量降低對靶基因檢測造成的抑制。明確內標的檢測結果Ct值范圍。建議科學設置內標，對待測樣本的取樣質量、試劑的反應體系進行監控。
4.1.6企業參考品
該類產品的企業參考品一般包括陽性參考品、陰性參考品、檢出限參考品和重復性參考品。應根據產品性能驗證的實際需要設置企業參考品。
企業參考品的設置建議如下：
陽性參考品：應著重考慮不同來源的病毒樣本和滴度要求，應至少選取不同來源的5個病毒樣本。
陰性參考品：主要涉及對交叉反應的驗證情況，建議包括冠狀病毒（HKU1、OC43、NL63、229E）、SARS冠狀病毒（可采用假病毒）、MERS冠狀病毒（可采用假病毒）、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等。
檢出限參考品：可采用95%陽性檢出水平或略高于檢出限的水平，如100%陽性檢出水平。
重復性參考品：建議包括高、低兩個濃度的樣本，其中一個濃度應為檢出限附近的濃度。
4.2生產工藝研究
明確產品主要生產工藝并進行優化研究。
