骨是一個能進行有限的自我修復和再生的功能性器官。由創傷、運動損傷或病理因素造成的骨軟骨損傷，涉及關節軟骨和軟骨下骨組織，超過了骨組織自身的修復能力，不能自行愈合，嚴重影響關節的正常活動，不僅給患者造成巨大的經濟和心理負擔，給社會帶來沉重的經濟負擔，是一項極具挑戰性的臨床問題。膜內骨化（Intramembranous ossification，IMO）和軟骨內骨化（Endochondral ossification，ECO）是骨器官胚胎發育和骨缺損修復再生的兩條途徑。目前用于治療骨缺損的生物材料主要通過 IMO 實現成骨修復，但常因血管化難以建立而導致骨再生 不良。從骨發育生理學和臨床角度來講，人體骨骼發育和骨折愈合主要通過 ECO 進行。ECO 通過間充質干細胞聚集成團、分化為軟骨細胞，以適應骨缺損處低氧和低血供的局部微環境，并進一步增殖成熟為肥大軟骨細胞，分泌血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）誘導血管侵入解決成骨中心區域血供不足的問題，最終轉化為成骨細胞分泌骨基質修復骨缺損。因此，基于ECO 構建生物材料是一種更理想的骨缺損修復策略。但是，其臨床應用仍然受制于 ECO 復雜的細胞行為和較長的體外細胞誘導周期。

圖1. 功能化微支架水凝膠復合體系調控干細胞軟骨內骨化行為修復骨軟骨缺損示意圖

近期，北京大學口腔醫學院魏世成教授和張雷主任醫師團隊在基于軟骨內骨化路徑的功能化海藻酸鈉微支架水凝膠體系修復骨軟骨缺損方面取得重要進展（圖1）。相關成果以標題“Functionalized Microscaffold−Hydrogel Composites Accelerating Osteochondral Repair through Endochondral Ossification”發表于ACS Applied Materials & Interfaces期刊。

本文亮點：

（1）制備功能化微支架水凝膠復合體系。海藻酸鈉是一種天然來源的陰離子線性多糖聚合物，由 D-甘露糖醛酸（M 單元） 和 L-古羅糖醛酸（G 單元）組成。金屬二價陽離子如鈣離子、錳離子等通過取代 G 單元中的鈉離子形成“蛋盒”結構將海藻酸分子鏈交聯并形成水凝膠，其結構與活組織的細胞外基質類似，并且具有良好的生物相容性、低毒性、相對較低的成本，已被廣泛研究并用于組織再生、藥物遞送、細胞移植等領域。然而，海藻酸鈉是生物惰性材料，其分子鏈上缺乏與細胞相關作用的位點，需要設計并利用生物仿生多肽共價接枝于海藻酸鈉鏈段上增強其生物活性，滿足組織工程的需求。在本研究中，我們引入了含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的肽（RGD），以促進細胞在支架材料中的黏附、增殖能力；并且引入了 VEGF 仿生多肽（QK）以促進體內血管招募和遷移能力；同時，我們利用懸滴法制備 3D 多孔海藻酸鈉微支架，其微米級別的孔徑相較于水凝膠支架納米級的孔徑更有利于細胞的生長和物質交換，并負載促軟骨生成小分子藥物 KGN 實現緩釋效果。

圖2. RQA-K@RAMS 的構建及表征

（2）功能化微支架水凝膠全階段調控并加速 hBMSCs 軟骨內骨化行為。RGD 多肽修飾的微支架因為其較大的比表面積和 3D 多孔結構可以重現細胞的增殖、聚集行為，并且有利于細胞和外部環境進行物質交換，水凝膠層不但避免了微支架表面的細胞流失和注射過程中因剪切應力導致的細胞損傷，而且為細胞提供了粘彈性微環境，進一步增強了細胞的黏附、聚集行為，并且有利于軟骨細胞增殖和肥大；功能化微支架水凝膠通過緩慢釋放 KGN，為 hBMSCs 軟骨向分化提供持續穩定的軟骨誘導微環境，形成更多的軟骨基質進一步促進了軟骨細胞 肥大化；QK 多肽在體內移植時通過招募血管內皮細胞形成有利于肥大軟骨細胞向成骨細胞轉化的血管微環境。本研究通過對接種于功能化微支架水凝膠的 hBMSCs 在進行體外軟骨內骨化 5 周的誘導，發現體外軟骨誘導 2 周就有較高的 COL10A1 的表達，并且通過裸鼠皮下異位成骨實驗發現體外軟骨誘導 2 周展示出了和體外軟骨誘導 3 周肥大 2 周的細胞-支架復合體相近的成骨礦化和血管招募能力，表明我們所構建的功能化海藻酸鈉微支架水凝膠通過調控細胞軟骨內骨化行為，可以顯著加速其軟骨內骨化進程，并在植入體內后表現出良好的成骨礦化和血管招募能力。

圖3. RQA-K@RAMS 調控hBMSCs軟骨向分化

 圖4. RQA-K@RAMS 調控軟骨細胞肥大

 圖5. 裸鼠皮下異位成骨實驗

（3）功能化微支架水凝膠復合體系促進骨軟骨缺損的原位組織修復。與負載外源性細胞相比，未負載細胞的功能化微支架水凝膠通過招募內源性細胞介導了骨軟骨缺損的雙層修復，在骨缺損表面形成了光滑的軟骨基質，骨缺損內部形成了致密的骨小梁，并伴有血管長入。

圖6. 功能化微支架水凝膠促進兔膝關節骨軟骨缺損的軟骨層修復

 圖7. 功能化微支架水凝膠促進兔膝關節骨軟骨缺損的軟骨下骨層修復