生物制藥過程中疑問權威匯總

 

Q: 搖瓶傳代時，P2用的A品牌搖瓶，P3用的是B品牌搖瓶，有什么影響，或者法律法規(guī)對這方面有什么說明指導？

 

A: 對于生產(chǎn)中使用的關鍵耗材應該固定不可以隨便更換，如果要更換需啟動變更流程，法規(guī)不會規(guī)定你使用哪個品牌的耗材的。

 

 

Q: 單克隆抗體的原液解凍是在哪里以什么樣的方式進行操作的？

 

A:（在制劑生產(chǎn)前）一般原液都是冷凍低溫保存的，解凍之后才能將若干袋原液進行混合過濾。

可以在前期研發(fā)時做凍融實驗。看情況，不是很著急的就放到2-8度冰箱里緩慢解凍，比較著急用就常溫水沖弄過幾種自身很容易降解的蛋白，但是也沒因為解凍而降解的。目前使用的是25攝氏度飲用水解凍，據(jù)說容易降解，現(xiàn)打算采用搖床解凍。

最好是用凍融機，可以快速溶解原液，保證蛋白活性不受損失。

 

 

Q: 公司生產(chǎn)注射用重組蛋白類生物藥（CHO細胞）一般其原液的生產(chǎn)過程都是從細胞復蘇--細胞培養(yǎng)、擴增--分離純化---原液檢定，整個周期一般需要40天左右，是否可以在保證傳代次數(shù)不超過規(guī)定的前提下，將培養(yǎng)擴增后的細胞作為下一批原液的種子細胞，縮短生產(chǎn)周期呢？

 

A: 首先是必須按照申報的工藝進行生產(chǎn)，不復蘇細胞是重大變更，如果想這么做，得做工藝驗證，產(chǎn)品穩(wěn)定性試驗，再申報變更，國家局批準后生產(chǎn)。這個周期很長，一般不會由廠家這么做。再者不復蘇細胞的話，不能保證每次培養(yǎng)細胞的生長特性一致，造成收率不一致，很影響產(chǎn)品質(zhì)量和效益。

統(tǒng)一復蘇一批，一起凍了，要用的時候拿一只出來擴增，擴增的步驟也一樣，保證原料起始一致，該凍起來的種子也是經(jīng)過中檢所驗證的，那么當然是比較好，不然的話，每天上罐的時候代次是不一樣的，也就不是同一株細胞，無法保證上罐之后細胞質(zhì)量一致~

 

 

Q: 菌種長期儲存會使活力下降，但對于長期儲存的菌種，尤其是基因工程菌來說，活化后還可恢復原來的活力嗎？

 

A: 氮保存兩年內(nèi)，超低溫保存一年內(nèi)，如果凍存步驟恰當，復蘇之后活力應該在95%以上。

 

 

Q: 不同產(chǎn)品的純化應當分別使用專用的層析分離柱。不同批次之間，應當對層析分離柱進行清潔或滅菌。不得將同一層析分離柱用于生產(chǎn)的不同階段。應當明確規(guī)定層析分離柱的合格標準、清潔或滅菌方法及使用壽命。層析分離柱的保存和再生應當經(jīng)過驗證。

這個分離柱的壽命，如何確定？

 

A: 主要是指填料。陰陽離子、親和，填料是有一定壽命的，吸附能力會逐步下降，就當清潔驗證那么做就可以了。最主要的標準就是洗脫效果、回收率什么的，自己定個標準，規(guī)定警戒線換填料。

這個驗證一般填料供應商會做的。 柱效就是柱子的效果，可以測試一下吸附能力 很簡單，用一定濃度的標準溶液過一遍柱子，看看填料吸附量多少，是否符合標準，能否起到過濾的作用。 另外用緩沖液沖洗柱子，檢測流出。

柱效就是柱子的效果，可以測試一下吸附能力很簡單，用一定濃度的標準溶液過一遍柱子，看看填料吸附量多少，是否符合標準，能否起到過濾的作用。另外用緩沖液沖洗柱子，檢測流出液，看看有多少殘留，填料是否還干凈等等有的公司定有效期的時候，是根據(jù)載量總數(shù)定的，有的是根據(jù)使用次數(shù)定的，根據(jù)具體情況設計驗證方案。

 

Q: 生產(chǎn)用種子批、細胞庫應當在規(guī)定的貯存條件下在不同地點分別保存，避免丟失。

 

A: 除避免丟失外，更主要是防止意外導致的種子活性降低、死亡等，所以，原始種子庫、主種子分開存放，單純低溫冰柜是不夠的，原始種子庫還應于液氮中備份保存。工作種子庫可直接放車間，不備份可以，備份更好。管理上，雙人雙鎖是最基本的，還應有監(jiān)控、記錄、報警等措施，包括冰柜溫度異常等。液氮中保存還應有液氮量的監(jiān)控。

 

Q: 同一超濾器能否用于同一產(chǎn)品的不同階段

 

A: 第一選擇：有條件的話最好分開用；第二選擇：退而求其次設備共用，但是濾芯或膜包分開專用。不認同全套共用。

濾膜、填料的結構及生物制品成分的復雜性決定了清潔驗證的效果很難保持長期一致性，你可能持續(xù)十幾個同樣的清潔程序都沒有雜質(zhì)檢出，但是一用到工藝上隨著條件的改變、甚至受到你的產(chǎn)品本身的影響，原來吸附的雜質(zhì)就下來了。清潔驗證所檢的項目都是已知的，但是生產(chǎn)過程中引入的未知的微量的有生物活性的成分說不清，不可能都考慮到。想想GMP為什么用平整、光滑、易清潔等規(guī)定。

有些問題是實踐出來的。柱層析本身即使你做了清潔驗證。實際情況也是放置一段時間后還在釋放吸附物。超濾本身是分子截留。情況會好一些。相對風險低。所以，一樓建議你不要使用同一個膜包。從認證角度說，你重復用在不同工序，會被現(xiàn)場質(zhì)疑的。從科學性角度說，我覺得可以考慮在低風險工序，或者說不要用于最后一個超濾工藝步驟。

 

Q: 發(fā)酵時使用的原材料（用于配制培養(yǎng)基，例如一些無機鹽等），進廠全檢后是否需要留樣；分離純化用到的有機溶劑，進廠全檢后是否需要留樣；

 

A: 無論是發(fā)酵的原材料還是分離純化的原材料，你都可以進行是否是關鍵物料的評估，評估為關鍵物料的，肯定需要進廠的每批進行全檢，非關鍵物料的可以定期全檢，每批檢測重點項目（如鑒別，含量等），至于留樣，在關鍵物料評估后如是關鍵物料，可根據(jù)物料是否易保存的性質(zhì)進行評估選擇性留樣，非關鍵物料可以不用留樣吧。GMP規(guī)定物料的留樣主要是針對制劑的原輔材。

 

Q: 進口原輔料應當符合國家相關的進口管理規(guī)定。具體的要求有哪些呢？

 

A: 1.境內(nèi)外上市制劑中未使用過的藥包材、藥用輔料，應進行關聯(lián)申報或由藥品注冊申請人按照2016年第155 號通告要求一并提交全部研究資料；如果已經(jīng)使用的，在報產(chǎn)的時候關聯(lián)。

2、現(xiàn)行版《中國藥典》已收載的，應符合現(xiàn)行版《中國藥典》要求；現(xiàn)行版《中國藥典》未收載的，應符合國家食品標準或現(xiàn)行版USP/NF、EP、BP、JP 藥典標準要求；其他輔料，應符合藥用要求。

3、輔料的合法來源證明文件，包括輔料的批準證明文件（含有效的藥用輔料注冊證、核準編號或?qū)嵭嘘P聯(lián)審批的藥用輔料《受理通知書》等）、標準、檢驗報告、輔料生產(chǎn)企業(yè)的營業(yè)執(zhí)照、《藥品生產(chǎn)許可證》、銷售發(fā)票、供貨協(xié)議等的復印件。

 

Q: 細胞培養(yǎng)和細胞純化階段的設備應該檢測哪些項目，限度又該怎么定？

 

A: 可降解蛋白質(zhì)產(chǎn)品，可以通過清潔的最終淋洗水和罐、管內(nèi)壁的TOC含量表示蛋白質(zhì)請清除程度。細胞和純化的不銹鋼容器清潔，因為是原液制備，不同于制劑配制罐，可以通過面積和最低反應日計量來計算具體的含量，所以一般規(guī)定淋洗水1～2ppm，表面1～2ppm/25cm2即可，如果最終淋洗水是注射用水，其pH，電導率，內(nèi)毒素、微生物接近注射用水水質(zhì)可以被認為清潔良好。

 

Q: 如何把細胞養(yǎng)的更漂亮？

 

A: 1. 不同的細胞，喜歡的環(huán)境是不一樣的。這個不僅僅是說培養(yǎng)基的不同，還有就是細胞生長的空間密度問題。有一些細胞是數(shù)量多一點比較好生長，生長狀態(tài)也比較好。這種一般是屬于生長速度慢的細胞。譬如內(nèi)皮細胞。而有一些是細胞是數(shù)量少一點細胞狀態(tài)會生長的比較好，譬如巨噬細胞和某些腫瘤細胞。尤其是巨噬細胞，生長速度非常得快，貼壁速度很快，所以傳代時就應該留很少量的細胞，這樣細胞狀態(tài)會比較好。并且巨噬細胞比較喜歡扎堆生長，而堆與堆之間是有空間的。如果長成相連在一起的一滿片的時候，細胞形態(tài)基本上就會差了，老化的會比較多，對后期實驗結果是不好的。所以在養(yǎng)細胞的時候應該摸索該細胞喜歡的生長空間密度問題。

2.對于有些人總是會遇到養(yǎng)的細胞形態(tài)怎么都不好的問題。這個其實是有一個方法可以改善的。對于貼壁細胞，如果細胞形態(tài)不好，（或者細胞形態(tài)不清晰，表面似有異物等）可以在傳代的時候進行如下操作：首先，倒掉舊的培養(yǎng)基，加入3ml新的培養(yǎng)基（有無血清的都可）洗滌一次，用滴管吸走，然后再加入3ml的培養(yǎng)基，進行預吹打，控制吹打力度，輕輕地大概沿著瓶底過一遍，然后吸走。這時侯再開始正式的消化、吹打。（巨噬細胞我們只吹打，不消化的）其次，把吹打下來的細胞懸液加入到新的培養(yǎng)瓶內(nèi)，培養(yǎng)瓶事先加入培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，按時間點觀察細胞貼壁情況。10分鐘觀察一次，20分鐘，30分鐘觀察一次。選擇一個時間點，已經(jīng)有部分細胞貼壁的情況下，重新置于潔凈臺，底面朝上迅速倒出其中的培養(yǎng)基，加入3ml新培養(yǎng)基再輕輕洗一次。然后加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。后續(xù)觀察細胞生長情況以及形態(tài)。我稱之為“二傳”。呵呵。)如果一次效果還不理想，可重復多次。直到找到細胞完美形態(tài)。其中要注意，結合細胞喜歡的生長情況。喜歡多一點數(shù)量長得好的細胞你就等貼壁細胞比較多點的時候再傳。反之亦然。這個是我?guī)熜职l(fā)明的，謝謝他了。這個方法真的很好用！

3.關于培養(yǎng)瓶內(nèi)加入培養(yǎng)基的量的問題。這個是要靠自己去摸索你所養(yǎng)的細胞的。并不是小的玻璃方瓶12ml，大方瓶14ml的。有些細胞反而是培養(yǎng)基少一點相反細胞形態(tài)會長得比較好。（可能也是競爭很大，有優(yōu)勝劣汰吧。呵呵。）對于生長速度快的細胞，易生長的細胞加少一點培養(yǎng)基細胞形態(tài)會更好。但是要注意換液掌握。

4.關于選擇培養(yǎng)瓶的問題。個人發(fā)現(xiàn)生長速度快的細胞在玻璃瓶內(nèi)生長的狀態(tài)會比一次性塑料瓶相對好一些。而對于同一種細胞，在其生長旺盛快速的時期在玻璃瓶內(nèi)的生長狀態(tài)也比塑料瓶內(nèi)好。這可能是因為塑料瓶比玻璃瓶更容易貼壁。生長速度快的細胞在塑料瓶這種相對“更安逸”的環(huán)境里反而長得狀態(tài)不如玻璃瓶好。所以對于生長速度慢的細胞如果想要更漂亮的細胞狀態(tài)，塑料瓶比玻璃瓶會好，對于生長速度慢的細胞，玻璃瓶則會更好。同樣，對于同一種細胞，在其生長速度慢的時候，塑料瓶會好一點，比如剛剛復蘇的時候，或者原代培養(yǎng)的時候。而在其生長旺盛的時候，玻璃瓶則相對會好一點。

 

Q: 單抗中吐溫80的作用是什么？

 

A: 表面活性劑，穩(wěn)定蛋白的作用，不穩(wěn)定的蛋白表面張力很容易讓蛋白聚集，TW80可隔絕氣液界面，改變張力，從而保護蛋白。

 

制劑部分，主要是增溶！

 

吐溫80在單抗制劑中是起穩(wěn)定劑作用，防止蛋白質(zhì)溶液出現(xiàn)團聚、沉淀。

 

Q: 請問病毒滅活如何驗證？目前使用的121度蒸汽滅菌，但是滅菌后蛋白變性很難清洗，想改為生產(chǎn)完后消毒劑滅活，請問如何驗證？

 

A: 121 是滅菌，病毒滅活不需要那么高的溫度，病毒滅活溫度，60~80℃  就可以滅活了。

 

溫度驗證，當然不能用真是的病毒來做，需要找到類似的模擬物，用模擬物代替病毒進行溫度驗證。

 

1.查資料，看你們單位的這種病毒滅活的溫度和時間。

2.如有可能最好，考察不同溫度點下，確認溫度及時間的接受標準。

3.溫度驗證，連續(xù)3次確認，在相同滅菌程序下的，模擬物內(nèi)的溫度和時間符合接受標準。

4.病毒滅活，生產(chǎn)同步測試，連續(xù)3次確認。滅活后，取樣測試。

 

Q: 細胞培養(yǎng)用的培養(yǎng)基是否要作為關鍵物料？

 

A: 培養(yǎng)基的好壞會直接影響細胞的生長，進而影響生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定，肯定算是關鍵物料。

輔料是可以最終制劑中存在的，原材料是可以過程去除的。

 

Q: 制劑中的一種輔料廠家生產(chǎn)地址發(fā)生變更，制劑需做哪些工作

 

A: 如果穩(wěn)定性結果與之前有差距，說明原料工藝發(fā)生了變化，估計你要重新評估了，首先是了解輔料工藝情況，其次輔料的相容性，然后是穩(wěn)定性考察

 

Q: 細胞生物制品做無菌檢驗，可以用上清做嗎？還是要用原液做？

 

A: 就樣品的代表性而言，上清液不能代替原液

 

 

Q: 生物制劑冷鏈運輸中的控溫漏洞，如何解決？

 

A: 大家都知道生物制劑如疫苗及血液用品冷鏈運輸?shù)闹匾浴Ｄ壳皣鴥?nèi)也通過各種政策不斷增強對冷鏈運輸及冷庫各環(huán)節(jié)的安全監(jiān)管。可是在冷鏈運輸過程中，即使使用監(jiān)控設備，仍然有很多風險和漏洞，如：

1.監(jiān)控設備斷電失聯(lián)；

2.檢測數(shù)據(jù)后臺可更改；

3.中轉(zhuǎn)裝卸過程中不受監(jiān)控，有超溫風險；

4.電子監(jiān)控設備乘飛機受限另外，產(chǎn)品在接收點/使用點處無法實現(xiàn)單品溫度監(jiān)控、缺少電子監(jiān)控設備，這部分也同樣存在風險點而作為消費者，更是無法從產(chǎn)品外觀上直觀了解產(chǎn)品運輸?shù)目販厍闆r，造成消費者對產(chǎn)品質(zhì)量的顧慮和不信任......國內(nèi)最新包裝的宮頸癌九價疫苗的內(nèi)包裝（塑料膜）上都貼了編號為“30China”的疫苗熱穩(wěn)定標簽（HEAT marker）。這意味著宮頸癌九價疫苗在37℃的環(huán)境下存放30天后還能繼續(xù)使用。疫苗熱穩(wěn)定標簽是一個銅錢形狀的貼紙，外圍圓圈部分為紫色，內(nèi)部為白色正方形，標簽會隨著溫度變化而變色，若標簽白色部分逐漸變成紫色或者更深的顏色，表明溫度已經(jīng)超出疫苗可承受的高溫暴露范圍，該疫苗必須報廢。能夠讓消費者更加直觀地辨別疫苗是否可以接種。

 

Q: 藥品生產(chǎn)用潔凈壓縮空氣的質(zhì)量控制。

 

A: 1. 壓縮空氣在制藥領域的應用壓縮空氣在藥品的生產(chǎn)過程中的應用十分廣泛，如菌苗類大罐發(fā)酵工藝、疫苗類半成品配制、原液及配液混合稀釋罐使用、 物料的轉(zhuǎn)移和吹掃、工藝系統(tǒng)滅菌后的保壓， 以及氣動式元件的控制等。由于與藥品生產(chǎn)直接接觸的壓縮空氣的品質(zhì)直接影響了產(chǎn)品質(zhì)量的好壞，因此，為了保證壓縮空氣的品質(zhì)，除了對壓縮空氣采取嚴格的凈化處理，還需要控制壓縮空氣的含油量和含水量。

 

2.壓縮空氣系統(tǒng)

2.1 潔凈壓縮空氣系統(tǒng)的組成壓縮空氣及凈化系統(tǒng)一般由產(chǎn)生、處理和儲存壓縮空氣的設備所組成的系統(tǒng)稱氣源系統(tǒng)，也稱為空氣壓縮系統(tǒng)。 壓縮空氣系統(tǒng)從功能上可以分成以下幾部分：

1)產(chǎn)生壓縮空氣的部分：如空氣壓縮機及其控制系統(tǒng)、 冷卻水系統(tǒng)等；

2)處理壓縮空氣部分：如干燥機、過濾器、除油器等；

3)輸送壓縮空氣部分：如儲氣罐、管路、閥門等

2.2潔凈壓縮空氣系統(tǒng)的工作原理空氣在壓縮 和輸送等過程不可避免 地與機器部件接觸，因此，空氣壓縮機輸出的壓縮空氣中可能含有大量有害雜質(zhì)，包括水、水霧、水蒸汽、凝結水；油，包括油霧、油蒸汽；各種固態(tài)物質(zhì)，如銹泥、金屬粉末、橡膠細末、焦油粒及濾材、密封材料的細末等；還有各種有害的化學異味物質(zhì)等。不通過適當?shù)姆椒ㄇ宄坏珪庠聪到y(tǒng)造成危害，還會在實際運用造成以下不利的影響：

1)壓縮空氣中的微生物和粒子會造成無菌產(chǎn)品的污染；

2)混合在壓縮空氣中的油蒸汽聚集到一定程度就會 形成易爆易燃源，而潤滑油汽化后會形成一種有機酸，容易腐蝕壓縮空氣管道內(nèi)表面以及氣動元件；

3)混入的微小顆粒（如塵埃、鐵銹等），極易損壞氣動元件，堵塞節(jié)流孔，更加嚴重的是極易對物料造成嚴重的污染；

4)混合在壓縮空氣中的水分，在一定的溫度壓力下就會飽和析出水滴， 當壓縮空氣與物料接觸時，極易對物料的質(zhì)量造成嚴重的影響；

5) 壓縮空氣溫度過高及產(chǎn)生水，對疫苗類及菌苗類生產(chǎn)有絕對性的危害。

 

3.潔凈壓縮空氣質(zhì)量標準

3.1 壓縮空氣質(zhì)量等級標準為了統(tǒng)一標準，國際標準 組織（ISO）所屬 空氣壓縮機、氣動機械及工具委員會（TC118）在 1986 年提出了關于壓縮空氣干燥凈化設備和壓縮空氣品質(zhì)的國際標準 ， 其中壓縮空氣質(zhì)量等級標準ISO8573.1 把壓縮空氣中的污染物分為固體雜 質(zhì)、水和油三種（我國等同采用了 ISO8573即國家標準GB/T13277－91《一般用壓縮空氣質(zhì)量等級》）。

2001年ISO 標準組織對 ISO8573.1 進行修改， 其主要變化表現(xiàn)在對固體顆粒的要求上。新標準對固體顆粒的數(shù)量進行了規(guī)定，這一變化是結合了纖維過濾器的實際性能，而且比較容易檢測，具體見表 12.2潔凈壓縮空氣企業(yè)質(zhì)量標準目前，用于藥品生產(chǎn)的潔凈壓縮空氣還沒有正式的國際或國家的質(zhì)量標準，參考上述質(zhì)量等級標準及GMP 對空氣潔凈度的要求，通過對上述質(zhì)量的綜合評估并結合企業(yè)實際需求和檢測方法，制定了企業(yè)潔凈壓縮空氣的質(zhì)量標準。

 

4.藥品生產(chǎn)用壓縮空氣質(zhì)量檢測壓縮空氣的檢測主要包括：粒 子數(shù)、微 生物數(shù)、含油量、含水量

4.1潔凈壓縮空氣含油量的檢測以德 國 ，德爾格DragerAerotest Simulan為例，將測量裝置連接到需檢測的潔凈壓縮空氣用氣口上，緩慢打開氣體閥門，對測量裝置進行沖洗2～3min，用切管器將標有“OilVapour”的水含量檢測管的兩頭切開，將油含量檢測管插入測量裝置上標有“Oil”的支撐管中，計時 5min 后，從測量裝置上取下檢測管，打開保護膜，等待 1min，根據(jù)指示層的變色情況判斷油含量。若氣體中油含量＜0.1mg/m3為合格。

4.2潔凈壓縮空氣含水量的檢測同油檢測方法，用切管器將標有“WaterVapour”的水含量檢測管的兩頭切開，將水含量檢測管插入測量裝置上標有“H2O”的支撐管中，計時 10min 后，從測量裝置上取下檢測管，根據(jù)指示層的變色情況來判斷氣體中水的含量。若氣體中的水含量＜100mg/m3為合格。

4.3微生物的檢測采用空氣浮游菌采樣器，通過收集懸浮在空氣中的生物粒子 1000L 于大豆蛋白瓊脂培養(yǎng)皿上，先經(jīng) 20~25℃培養(yǎng) 72h，再經(jīng) 30~35℃培養(yǎng) 48h，讓其繁殖到可見的菌落數(shù)后進行計數(shù)，每個測點的浮游菌濃度必須低于 1cfu/m3 。

 

以上是推薦的后處理流程圖因此，對于壓縮空氣在制藥應用方面是沒有確定性的，在不同的生產(chǎn)工藝所要求的氣體品質(zhì)也是不一樣的，但是必須保證最低標準目前，藥品安全仍然是不容忽視的問題。 制藥行業(yè)壓縮空氣對藥品質(zhì)量有極其重要的作用，對目前廣泛存在于設計、施工和使用管理方面的許多問題，應引起有關部門的高度重視，根據(jù)各個環(huán)節(jié)的實際情況，逐步對其行為加以規(guī)范。 并且，隨著自動化水平的提高和無人化操作的實現(xiàn)，必將消除壓縮空氣最大的污染源，也可從根本上保證潔凈室的無菌效果。 此外，藥品生產(chǎn)過程中壓縮空氣系統(tǒng)進一步優(yōu)化，對其進行高效潔凈改造，提高其運行效率，將成為一個重要工作，這具有巨大的經(jīng)濟效益與社會效益

 

Q: 生物制品對不銹鋼材質(zhì)的要求 

 

A: 高氯濃度等都可能腐蝕不銹鋼，哪怕是316L；所以應考慮降低接觸時間或選取其它材質(zhì)（不銹鋼鍍膜等）；對于接觸高氯體系等情況，不銹鋼也比較難在驗證/確認時評估通過。

 

看你是配液還是儲液，配液接觸時間端短，一般鹽溶液濃度不是很高的話，316L能夠承受，好一點用904L。儲液的話接觸時間較長，用254或者2507。最好的就是鈦材了，但是這玩意造假特貴，或者選用鍍鈦可能便宜一些。