（FDA 2018/05/21 現行定稿指南）
I. 介紹
本指導原則有助于研究用新藥申請（IND）或新藥申請（NDA）、仿制藥申請（ANDA）、生物制品許可（BLA）和補充申請的申請人在需要 藥代動力學、毒代動力學或生物標志物濃度評估的人體臨床藥理學、生物利用度（BA）、生物等效性（BE）研究的生物分析方法驗證。2 該指南還可以為需要毒代動力學或生物標志物濃度數據的非臨床研究的生物分析方法的開發提供參考。對于獸藥批準過程相關的研究，如研究用新動物藥申請（INADs），新動物藥申請（NADAs）和簡化新動物藥申請（ANADAs），本指南可適用于血液和尿液 BA、BE 和藥代動力學研究。本指南中的信息適用于定量測定生物基質（如全血、血清、血漿、尿、組織例如皮膚）中藥物、代謝物、治療用蛋白、和生物標志物水平的生物分析方法，如色譜分析（CC）和配體結合分析（LBA）。本定稿指南考慮了2013年指南草案收到的公眾意見，并為生物樣品分析方法的開發、驗證和試驗中的使用提供建議。根據生物分析方法的具體類型，如果有合理性依據，可以修改本指南的建議。本指南反映了生物分析方法驗證方面的進展。通常，FDA指南文件不具有法律執行責任。指南介紹了FDA對于某一話題的當前看法，除非引用了特定的監管或法律要求，指南應僅被視作建議。“should”在FDA的指南文件中意為某事是建議或推薦做法，不是規定。
II. 背景
2001年“生物分析方法驗證”行業指南最初是基于兩個研討會的考慮，這兩個研討會的題目是：
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分析方法驗證：生物利用度，生物等效性和藥代動力學研究3
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以下額外的研討會，為后續修訂提供參考（例如，2013年的指南草案“生物分析方法驗證”5):
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定量生物分析方法驗證和實施：色譜和配體結合分析的最佳實踐2
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美國藥學科學家協會 / FDA“用于評價方法重現性的試驗樣品再分析”的研討會7
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美國藥學科學家協會（AAPS）舉辦的“定量生物分析方法驗證和實施 – 2013年版FDA指南”研討會8
特定生物基質（如血液，血漿，血清或尿液）中的分析物（即，藥物、包括生物制產品及其代謝物）和生物標志物進行定量評估的經過驗證的分析方法，對于非臨床、生物藥劑學、和臨床藥理學研究的成功實施是至關重要的。這些經過驗證的方法提供了關鍵數據，以支持藥品和生物制品的安全性和有效性。分析方法的驗證通過解決以下關鍵問題，可確保數據的可靠性，關鍵問題包括：
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該方法是否可以檢測預期的分析物？例如，是否有物質干擾檢測，分析方法是分析物特有的或選擇性的方法？
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與檢測相關的變異性是多少？例如，該方法的準確度和精密度？
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提供可靠數據的檢測范圍是多少？例如，該方法的靈敏度是多少（例如，該方法的定量下限（LLOQ）、定量上限（ULOQ）是多少？）
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樣品采集、處理和儲存如何影響生物分析方法數據的可靠性？例如，樣品收集時需要遵循哪些步驟？運輸過程中是否需要冷凍樣品？需要什么樣的溫度來儲存樣品，樣品可以儲存多長時間？
對已驗證的方法進行更改時，申辦者應進行額外的驗證（即，部分驗證或交叉驗證）。
符合目的（fit-for-purpose ，FFP）的概念指出，驗證的水平應適合研究的預期目的。上述列出的關鍵問題應該相對于藥品開發階段進行評估。在NDA、BLA或ANDA中的關鍵研究（如，BE或藥代動力學研究），需要做出批準、安全性或標簽的決定，應該包括充分驗證的生物分析方法。不用于支持監管決定的探索性方法（如，候選人選擇）可能不需要這樣嚴格的驗證。 該“符合目的”的概念適用于藥品、代謝物和生物標志物。進行用于監管提交的毒理學研究的分析實驗室應遵守21 CFR 58，良好實驗室規范（GLP）。9 用于人體BA、BE和藥代動力學研究的生物分析方法必須符合 21 CFR 320 “生物等效性和生物可用性要求”（即，21 CFR 320.29）中規定的標準。以下章節討論了生物分析方法的開發、驗證和研究中的使用，以及如何最好地記錄驗證方法和結果。本指南中使用的方法參數和分析術語的定義，請參見術語表。
III. 生物分析方法的開發和驗證
A. 指導原則
生物分析方法開發的目的是確定方法的設計、操作條件、限制和適用性符合預期目標，并確保方法經過優化。在生物分析方法開發之前，申辦者應該了解目標分析物（例如，確定藥物的物理化學性質，體外和體內代謝，以及蛋白質結合）并考慮可能適用的任何已有分析方法的方面。方法開發和驗證的要素和接受標準總結在表1中。表2描述了申辦者如何記錄生物分析方法的開發和驗證，以及應該存儲或提交的位置。方法開發包括提取和檢測分析物有關的規程和條件的優化。 方法開發包括以下生物分析參數的優化（將在第III.B章節中詳細討論）以確保該方法適用于驗證：
生物分析方法開發不需要大量的記錄保存或注釋。但是，申辦者應該在開發生物分析方法的過程中記錄規程的變更，以及任何問題及其解決方案，以便為方法開發過程中的任何變更提供依據。
生物分析方法驗證表明，最優化的方法適合試驗樣品的分析。 申辦者應該：
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對任何新的生物分析方法進行全面驗證，以分析新藥物實體、代謝物或生物標記物。
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對增加代謝物或額外分析物的現有已驗證方法的任何修訂，進行全面驗證。
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在開始驗證之前，為生物分析方法建立詳細的書面描述（例如，方案、研究計劃和/或標準操作規程（SOP））。描述應該確定從采樣時間到分析時間，控制方法中的關鍵參數（例如，環境、基質、規程變量）的規程，以盡量減少它們對基質中分析物測量的影響。
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記錄和報告（在方法驗證報告中）用于聲明或得出“該方法有效性”結論的所有試驗。
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驗證生物基質中每種分析物的檢測結果。表1具體列出了每個生物分析參數的具體要求和接受標準。
B. 色譜分析（CC）和配體結合分析（LBA）的生物分析參數
下面討論適用于CC和LBA的生物分析參數。單獨針對CC或LBA的問題已具體指出。
1. 對照標準物質和關鍵試劑
申辦者應對所有對照標準物質和關鍵試劑（如，抗體、標記的分析物和基質）進行適當的特征描述和記錄（如，確定鑒別、純度和穩定性），并將其存儲在特定的條件下。用于制備校正標樣和質控樣品的對照標準物質的純度會影響試驗數據。因此，申辦者應使用具有已知鑒別和純度的已認證對照標準物質來制備已知濃度的溶液。對照標準物質應與分析物相同；然而，當這種情況不可行時，申辦者可以使用已知純度的已建立的化合物形式（例如，游離堿、游離酸或鹽）。對市售可得的標準物質，申辦者應提供分析證書（CoA），包括來源、批號和有效期日期（美國藥典（USP）標準品例外）。對于沒有CoA的內部或外部標定的標準物質，除了來源和批號外，申辦者還應提供標準品鑒別和純度的證據。使用超出有效期的標準物質時，申辦者應提供最新的CoA或重新確定標準物質的鑒別和純度。如果標準物質超出有效期，申辦者不應該使用這批標準物質配制儲備液，除非重新建立標準物質的純度。對于內標（IS），如果證明IS適用于特定用途（例如，對分析物沒有干擾），則申辦者不必提供CoA或純度證明。申辦者應適當地表征和記錄關鍵試劑（即，確定其身份、純度和穩定性），包括但不限于任何標準物質、抗體、標記的分析物和基質。當關鍵試劑發生變化時，分析驗證非常重要，如批次間變化或換為其他試劑。例如，如果標記的分析物、檢測試劑或抗體發生變化，申辦者應該：
2. 校準曲線
在方法開發過程中，申辦者應根據特定試驗中預期的濃度范圍選擇方法定量范圍和校正標樣的濃度。對于LBA，除了校正標樣外，定量范圍之外的錨定點可以幫助擬合曲線。不應將錨定點用作運行接受標準的一部分。對于大多數LBA，校準（標準）曲線本質上是非線性的，并且通常，LBA需要比CC更多的校正標樣來定義校準曲線范圍內的擬合。另外，LBA標準曲線的響應 – 誤差關系是平均響應的變量函數（即，變異性heteroscadisticity）。申辦者應使用充分描述濃度 – 響應關系的最簡單模型，以及適當的加權方案和回歸方程。對于LBA，濃度 – 響應關系通常適合采用四參數或五參數回歸模型，但也可以評估其他模型。當方法驗證時，校準曲線應該是連續的和可重現的。申辦者應該使用與預期試驗樣品相同的生物基質制備校準標準。試驗樣品可能含有多個分析物。申辦者應該為樣品中的每個分析物生成校準曲線。當需要替代基質時，申辦者應該證明和驗證校準曲線。表1列出了校準曲線的要求，包括LLOQ，ULOQ和接受標準。
3. 質控樣品
質控樣品用于評估方法的精確度和準確度以及樣品的穩定性。申辦者應該使用與已驗證的方法待分析的試驗樣品相同的基質來制備質控樣品。在方法開發過程中，建議使用新制備的質控樣品進行精密度和準確度分析，因為此時通常尚未產生穩定性數據。在方法驗證期間，質控樣品用于評估方法性能和分析物的穩定性。在驗證運行中包括性能質控樣品，以確定方法的精密度和準確度（見第III.B章節）。穩定性質控樣品評估分析物在各種應力條件下的穩定性（關于質控樣品濃度的選擇，請參見第III.B章節）。質控樣品的配制應該與校正標樣使用不同的儲備液。然而，如果申辦者可以證明使用由不同儲備液制備的校正標樣和質控樣品、在一次驗證運行中的精密度和準確度，那么申辦者可以在隨后的運行中使用由該儲備液制備的校正標樣和質控樣品。申辦者應該在沒有干擾或基質效應的大量空白基質中制備校正標樣和質控樣品。
4. 選擇性和特異性
在方法開發過程中，申辦者應確認被測物質是目標分析物，以盡量減少或避免干擾。該方法的選擇性通常通過分析多個來源的適當生物基質（例如，血漿）的空白樣品而被證明。根據方法的預期用途，可以在選擇性評估中包括溶血樣品、高血脂樣品或來自特定人群的樣品的影響。當使用液相色譜/質譜（LC / MS）方法時，申辦者或申請人應確定基質對離子抑制、離子增強或提取效率的效應。應該評估內標以避免干擾分析物。生物基質中潛在的干擾物質包括內源性基質成分，如代謝物，分解產物 - 以及實際試驗 – 同時服用藥物和其他外援物。如果在樣品采集期間使用穩定劑或酶抑制劑，申辦者應評估對分析物定量產生干擾的可能性。申辦者應該對方法開發過程中評估這些（以及其他任何潛在干擾）的需求做出合理性依據。在驗證過程中，申辦者應確認該方法不含潛在的干擾物質，包括內源性基質成分、代謝物、預期的同時服用藥物等。如果試驗樣品含有多個分析物，并且分析物旨在通過不同的方法進行定量，申辦者應該檢測每種方法是否受到其他分析物的干擾。申辦者應分析至少6個（對于CC）或10個（對于LBA）個體來源的適當生物基質（例如，血漿）的空白樣品。申辦者應確保在整個方法的應用過程中不存在基質效應。關于選擇性和特異性要求和接受標準的細節，請參見表1。對于LBA，研究來源于結構或生理學相似分析物（即，外源性干擾）或基質效應（即，內源性干擾）的干擾是非常重要的。研究外源性干擾涉及確定可能干擾結合相互作用的分子的交叉反應性，包括與藥物、任何代謝物、同時服用藥物（及其重要代謝物）或內源性基質組分結構相關的分子。申辦者應單個評估每個因素，并結合目標分析物來確定其引起干擾的能力。基質效應評估涉及將多個來源的生物基質的標準曲線與平行基質（用于評價方法重現性的連續稀釋）和非特異性結合基質的標準曲線進行比較。申辦者應該消除或減少任何重大干擾。如果這種嘗試不成功，申辦者可以考慮開發正交方法以消除或最小化干擾。在分析方法中可能發生樣品之間的殘留。申辦者應在方法開發過程中消除任何殘留。如果無法消除殘留，申辦者應評估方法驗證期間的殘留對試驗樣品濃度準確度的影響。
5. 靈敏度
定量下限 （LLOQ）確定了方法靈敏度，應在方法開發過程中確定。應開發和驗證該方法，使其能夠滿足預期研究樣品所需的要求。LLOQ評估可以單獨完成，也可以作為校準范圍精密度和準確度評估的一部分。表1列出了驗證靈敏度的具體要求。
6. 準確度，精密度和回收率
在方法開發過程中評估定量范圍內的準確度和精確度對于確定該方法是否可以進行驗證并涉及分析在整個檢測范圍內多個濃度的重復質控樣品是至關重要的。具體而言，申辦者應評估在定量下限、低、中、高質控樣品（以及LBA方法的定量上線）的性能，以確定該方法是否適合分析研究樣品。用于估算準確度和精密度的方法驗證試驗應包括在多天內進行的最少三次（對于CC）和六次（對于LBA）的獨立運行（即，精密度和精確度（A＆P）運行；參見表1）。每次A＆P運行應包括1條標準曲線和重復分析的多個質控樣品濃度。申辦者應該根據A＆P運行中質控樣品的性能確定方法的準確度和精確度。表1列出了準確度和精密度以及A＆P運行的具體驗證要求。申辦者應在所有A＆P運行中使用新制備的校正標樣和質控樣品。在所有A＆P運行中最好使用新鮮制備的質控樣品；然而，如果這不可能，申辦者應該在一次或多次A＆P運行中使用新制備的質控樣品。申辦者應優化分析物的回收率以確保提取效率和重現性。回收率不一定是100％，但是分析物和內標回收的程度應該是一致的和可重現的。申辦者應通過比較提取樣品的分析結果和空白中加入提取后分析物的相應提取物（即，代表100％的回收率），進行回收率實驗。回收率評估對于LBA不是必需的，除非涉及樣品提取。回收率試驗應按照表1中的描述進行。
7. 穩定性
在方法開發過程中，申辦者應確定給定基質中分析物的化學穩定性，包括樣品收集、處理和分析物儲存的影響。申辦者應評估自動取樣器、實驗臺、處理或提取過的樣品、凍融，儲備液和分析物的長期穩定性。申辦者應評估與試驗樣品相同基質的穩定性; 然而，當基質很稀少時，申辦者可以探索使用合適的替代基質。對于復方給藥，或特定藥物方案的藥物，應在其他藥物的存在下評估分析物的穩定性。申辦者還應該考慮在研發的藥物適應癥下，通常已知患者同時服用藥物的情況下分析物的穩定性。根據分析物以及采樣和分析條件，在方法開發過程中評估分析物在全血中的穩定性可能是有用的。例如，藥物可能在全血中不穩定或在采樣期間吸附到細胞組分。在驗證過程中，穩定性評估應涵蓋在分析場地接收之前的預期樣品條件（例如，在臨床場地、運輸過程中和所有其他二級場地）以及在分析站點接收和分析期間的收據。生物液體中藥物穩定性的驗證是儲存條件、藥物的物理化學性質、基質和容器系統的作用。分析物在特定基質和容器系統中的穩定性僅與該基質和容器系統有關，不應外推至其他基質和容器系統。如果儲存條件改變或在經驗證的儲存條件之外進行樣品分析，則應在新條件下重新建立穩定性。如有必要，應對全血中分析物的穩定性進行重新驗證（例如，如果分析物在采血過程中不穩定）。表1列出了穩定性的具體要求和接受標準。與基質相關的穩定性試驗應將穩定性質控樣品與新制備的質控樣品新做出的標準曲線比較。盡管最好使用新制備的校正標樣和質控樣品，但在某些情況下（例如，對于大分子），可能需要過夜冷凍。在這種情況下，申辦者應提供合理性依據并證明凍融穩定性。所有穩定性檢測（參見下面的列表）應該使用在適當的無分析物、無干擾的生物基質中、由新鮮分析物儲備液制備的分析物制備的一組樣品。
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自動取樣穩定性：只有當自動進樣器儲存條件不同或未被提取（或經過處理的樣品）的穩定性覆蓋時，申辦者才應證明提取物在自動進樣器中的穩定性。
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實驗臺穩定性：申辦者應確定樣品在試驗樣品預期實驗室處理條件下的穩定性（例如，樣品保存在室溫下或在冰桶中的穩定性）。
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提取（或經過處理的樣品）的穩定性：申辦者應評估經過處理的樣品穩定性，包括與新鮮制備的校正標樣相比，在自動取樣器中的停留時間。
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凍融穩定性：申辦者應在最少三次凍融循環后評估樣品的穩定性。質控樣品應按照與試驗樣品相同的規程融化和分析。質控樣品在兩個循環之間應冷凍至少12小時。應將凍融穩定性質控樣品與新鮮制備的校準曲線和質控樣品進行比較。
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長期穩定性：申辦者應確定樣品在一段時間內的長期穩定性，該時間段等于或超過首次采樣和最后一次樣品分析的日期。試驗用儲存溫度應與用于儲存試驗樣品的溫度相同。長期穩定性質控樣品應與新制備的校準曲線和質控樣品進行比較。在零下20ºC時測定穩定性可以覆蓋較低溫度下的穩定性。
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儲備液穩定性：不應采用即將到期的標準物質制成儲備液，除非儲備液中分析物的純度被重新確定。當儲備溶液以不同的狀態（例如，溶液對固體）存在，或與認證的標準物質有不同的緩沖液組合（對于大分子通常是這種情況），申辦者應該有儲備液的穩定性數據，以證明儲備液儲存穩定性。
8. 稀釋效應
如果該方法用于檢測稀釋的樣品，應在驗證期間監測稀釋可靠性 通過用類基質（like matrix）稀釋定量上限（ULOQ）以上的質控樣品以使其在定量范圍內，并且應證明這些稀釋的質控樣品的準確度和精確度。在驗證過程中使用的稀釋應該模擬試驗中預期的稀釋。應該在LBA中證明前帶效應。參見表1的具體要求和接受標準。
9. 部分和交叉驗證
部分驗證用于評估已驗證的生物分析方法的修改。部分驗證的范圍可以從一個批內（intra-assay）準確度和精密度測定到幾乎完整驗證。根據要求，部分驗證的原始數據應保存在分析場地以供檢查。屬于該類別的典型生物分析方法修改或變化包括但不限于以下內容：
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在收集生物液體時抗凝劑的變化（例如，肝素轉為EDTA，但是平衡離子不變）
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物種內基質的變化（例如，從人體血漿轉換為人體血液）或基質內物種的變化（例如，從大鼠血漿轉換為小鼠血漿）
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LBA關鍵試劑的變化（例如，批次間變化、試劑變化）
b. 交叉驗證
交叉驗證是對兩種或多種生物分析方法或技術的驗證參數進行比較，用于在同一試驗或不同試驗中生成數據。此外，在單個試驗中的樣品分析在多個場地或多個實驗室進行時，交叉驗證是必要的。在這種情況下，應采用共同基質的質控樣品和未混合的受試者樣品在每個場地或實驗室進行交叉驗證，以確定實驗室間的可靠性。當體積不足時，可以使用混合樣品。在SOP或驗證計劃應該預先確定標準。
C. 驗證方法：試驗分析和報告的預期
本節介紹了使用已驗證的生物分析方法進行常規藥物分析的預期。表1列出了具體要求和接受標準。
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如果評估系統適用性，應使用特定的SOP。應使用獨立于當前試驗校正標樣、質控樣品和試驗樣品的樣品確定系統適用性，包括儀器條件和儀器性能。應保持系統適用性記錄，以供審計。
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在所有分析運行中應包含標準曲線和質控樣品（詳見表1）。質控樣品應涵蓋預期試驗樣品濃度范圍。
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通常，在驗證過程中確定的曲線擬合、加權和擬合優度應該在試驗中的校準曲線使用。驗證和試驗樣品分析之間的響應- 函數關系的變化表示潛在的問題。應該預先制定SOP以解決這些問題。
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總的質控樣品應至少占總樣品數量的5％，或至少6個（低、中、高質控樣品，兩份重復），以較高數量為準（參見表1）。應該在一次運行的所有不同分析批中中使用重復的低、中、高質控樣品。
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如果試驗樣品濃度聚集在標準曲線的較窄范圍內，則應增加額外的質控樣品以覆蓋樣品范圍。如果在試驗之前，額外的質控樣品濃度沒有包括在已驗證的質控樣品范圍內，則應在繼續分析之前證明額外質控樣品的準確度和精確度。如果部分驗證是可接受的，那么已分析過的樣品不需要重新分析。
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在處理和分析過程中，質控樣品應該與試驗樣品分開進行。
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在每次分析過程中，應確認在定量下限（LLOQ）沒有分析物干擾（參見表1選擇性和靈敏度）。
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如果不符合校準和/或質控樣品接受標準，則分析運行失敗（參見表1）。
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在試驗樣品分析過程中，應將包含符合接受標準的分析運行的質控樣品結果（包括異常值）納入準確度和精密度的評估中。應報告所有分析運行的質控樣品結果（合格和不合格），但不合格運行的質控樣品結果不需要作為準確度和精密度估算的一部分。
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如果生物分析方法需要將整個分析運行分為不同的分析批（例如，在明顯不同的時間、不同的分析員處理的樣品組），則每個不同批次應處理所有水平的重復質控樣品（例如低、中、高）以及試驗樣品。例如，當樣品數量超過96孔板的容量或固相提取歧管不能容納所有樣品時。請參見表1了解基于質控樣品接受標準的可接受運行。在不符合質控樣品接受標準時，分析運行中的不同批次或批次可能會被拒絕，但是剩余批次可能合格，因為分析運行符合整體質控樣品的接受標準。
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試驗定量下限（LLOQ）以下所列濃度的試驗樣品應報告為低于LLOQ（BQL）。試驗濃度高于定量上限（ULOQ）的樣品應稀釋并重新分析，或應擴展標準曲線并重新驗證。
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試驗樣品稀釋液應使用相同的基質（例如，人體血漿至人體血漿）。
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生物基質中一個分析物在所有試驗樣品的檢測應在穩定性數據涵蓋的時間段內完成。如果樣品處理條件發生變化或超過有效的穩定性數據，則應在新條件下確定樣品的穩定性。
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對于CC，應該監測內標響應的變異性。SOP應該預先行設定，以解決內標變異性的問題。
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應該監測漂移，并且如果它對未知樣品濃度評估準確度有影響的話（例如漂移對散布的質控樣品的準確性的影響），應該解決。
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所有來自一個受試者的試驗樣品應該在一次運行中分析，特別是針對個別受試者重復檢測的試驗設計（例如，BE試驗所需的交叉或順序設計）。如果采取其他方法，申辦者或申請人應該證明該方法合理，并采取措施減少州期間的變異性。
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應該監測殘留，如果有的話，應解決其對試驗樣品定量分析的影響。
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應進行用于評價方法重現性的試驗樣品再分析（ISR）（見第IV節表1和表2）。
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應預先確定描述重新分析原因的SOP或指南。重新分析僅適用于系統原因（例如，樣品高于定量上限ULOQ、樣品處理錯誤、設備故障、色譜分析不良）。SOP應包括重新分析的接受標準，申辦者或申請人應報告最終值。具體要求如表1和表2所述。重新分析和報告的基本原理、方法和所有數據應清楚記錄。
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對于涉及多個分析物的試驗樣品，不能因為一個分析物不符合接受標準而拒絕另一個分析物的有效結果。
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如果在人體試驗中發現獨特或不成比例的高濃度代謝物，則可能需要根據活性、針對代謝物開發完整驗證的檢測方法，（參見FDA行業指南“藥物代謝物安全性檢測” 10 )。
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應預先建立CC樣品數據重新積分的SOP或指南。本SOP或指南應確定重新積分的標準以及重新積分如何進行的方式。重新積分的理由應該清楚地描述和記錄。應該保持審計追蹤。原始和重新積分的數據應該記錄并報告。
