以下亞硝胺雜質的相關總結，主要是參考FDA的文件《Control of Nitrosamine Impurities in Human Drugs Guidance for Industry（人用藥物中亞硝胺雜質的控制行業(yè)指南）》和《Recommended Acceptable Intake Limits for Nitrosamine Drug Substance-Related Impurities (NDSRIs) Guidance for Industry（亞硝胺類藥物雜質（NDSRIs）推薦可接受攝入量限度行業(yè)指南，RAIL 指南）》進行的，對亞硝胺雜質的分類、形成脈絡、相關雜質的控制限度、以及可能的控制措施進行了一個總結。目前國內還頒布了《化學藥物中亞硝胺類雜質研究技術指導原則（試行）》，在CDE的審批過程中，也與對該項進行過多次發(fā)補，故也是我們藥品開發(fā)過程中需要重點關注的內容。
01亞硝胺雜質的分類：
現在普遍存在的亞硝胺類雜質，主要是分為兩種結構類別，一類是小分子亞硝胺類雜質，還有一類是亞硝胺藥物物質相關雜質(NDSRIs)。
1.1 小分子亞硝胺類雜質：該類雜質與藥物的結構相關性不高，可能存在與多種藥物中。目前主要包含N-亞硝基二甲胺（NDMA）、N-亞硝基二乙胺（NDEA）、N-亞硝基甲基苯胺（NMPA）、N-亞硝基二異丙胺（NDIPA）、N-亞硝基異丙基乙胺（NIPEA）、N-亞硝基二丁胺（NDBA）和 N-亞硝基-N-甲基-4-氨基丁酸（NMBA），結構式詳見圖1。
▲圖1-小分子亞硝胺雜質結構圖
1.2 NDSRIs：該類雜質與藥物活性成分（API）的結構相關的亞硝胺類雜質（化學結構中一般含有API或者API的片段，對于每一種API來說都是不一樣的），一般是API在合成、儲存過程中產生。與小分子亞硝胺的典型區(qū)別在于是否與藥物中的活性成分的結構相似性。
02亞硝胺雜質形成的原因
亞硝胺[（R1N(-R2)-N=O）]是一類亞硝基與胺基結合形成的化合物，如圖2所示，這些胺類[仲胺（二級胺）、叔胺（三級胺）和季胺（四級胺）]的化合物與亞硝酸（一般是酸性條件下的亞硝酸鹽）之間進行亞硝化反應，生成亞硝胺類的雜質。還有一種情況是1,1-二取代肼類化合物，該類化合物可以被氧化，從而形成亞硝胺。
▲圖2-形成亞硝胺的代表性反應（二級胺）
在前體胺（二級、三級、四級胺或者亞硝酸鹽都被稱為前體胺）存在的情況下，若將疊氮化物作為引入四環(huán)唑或者疊氮基團的引入劑，當采用亞硝酸作為殘留疊氮化物的猝滅劑的時候，亞硝胺類雜質的產生風險會被提高。
2.1 在藥物活性成分中，小分子亞硝胺類雜質存在的原因
① 合成過程中，當原材料、中間體、API（或者API的降解產物）、試劑或者催化劑中出現二級胺、三級胺或者四級胺，又同時存在亞硝酸（或者亞硝酸鹽與酸性條件）時，就會形成亞硝胺類雜質。
② 酰胺溶劑在有些條件下會發(fā)生降解，就會產生二級胺（例如，高溫條件下N,N-二甲基甲酰胺會被降解為二甲胺）。二級胺（二甲胺）也可能作為雜質存在于酰胺溶劑中。三級胺或者四級胺作為試劑，也可能會引入二級胺。
③ 供應商采購的原材料也可能帶來亞硝胺或者它的前體。比如：溶劑運輸過程中，雜質在存儲容器之間的轉移；API起始材料或者中間體在生產時，與其他工藝產生的亞硝胺雜質的較差污染等，也是我們需要關注的點。
④ 回收使用的溶劑、試劑和催化劑也可能作為亞硝胺雜質的來源，因為回收使用的物料很可能會用于不同的生產工藝，可能帶來亞硝胺雜質的交叉污染。
⑤ 缺乏工藝優(yōu)化和控制措施（例如在高溫干燥和氣流粉碎工藝中，空氣中的氮氧化物與活性成分中可能存在的二級胺、三級胺或者四級胺反應，就會為亞硝胺的形成創(chuàng)造可能的條件）。
2.2 非藥物活性成分來源的藥物產品中的亞硝胺
① 輔料中引入（多種常用輔料中含有亞硝酸鹽、飲用水中也可能含有亞硝酸鹽）
② 包裝容器和制造設備也可能引入亞硝酸鹽或者亞硝胺類雜質（因此在包材的可提取物或浸出物的研究中需要對此類雜質進行評估）
2.3 NDSRIs存在于藥物產品的根本原因
NDSRIs可在藥物產品的制造過程中或成品藥物產品的儲存期間產生。現在已知的根本原因有：
① 亞硝化雜質（如輔料中的殘留亞硝酸鹽或藥物產品中存在的其他亞硝酸鹽），在某些條件下導致含有二級胺、三級胺或者四級胺的活性成分亞硝化產生NDSRIs。
② 從活性成分本身帶入的NDSRIs。（一般情況下，高水平的NDSRIs更多與藥物產品相關，因為其通常是由藥物活性成分與藥物產品中存在的亞硝酸鹽雜質之間的反應產生的，基于該原因，也會導致存儲期間的亞硝胺雜質的增加）
03亞硝胺雜質的控制限度
基于亞硝胺雜質是可能或者疑似的人類致癌物，故我們需要對其進行風險控制，常用AI（可接受攝入量）來進行風險評估。ICH M7（R2）中定義的AI限度是基于藥物物質（活性成品）和藥物產品中致突變雜質的每日暴露量的保守假設，是在一生中（70年）使每100000名受試者中增加一例癌癥風險的近似水平。
特別注意：而ICH發(fā)布的行業(yè)指南《Q3A新藥原料中的雜質》（2008年6月）以及《Q3B（R2）新藥制劑中的雜質》（2006年8月）則適用于用于治療晚期癌癥的藥品中存在的亞硝胺雜質。
確定AI限度值可以用以下方法進行確認：
3.1 當特定亞硝胺化合物的可靠致癌性數據和其他安全信息（包括細菌致突變性數據）不可用時，FDA推薦使用預測致癌效力分類方法確定AI的限度。
FDA公布的RAIL指南中的預測致癌效力分類方法主要是適用于N-亞硝基基團兩側各帶有碳原子的NDSRIs，其中碳不直接與雜原子雙鍵相連（即N-亞硝基酰胺、N-亞硝基脲、N-亞硝基胍和其他相關結構除外）。此外，預測致癌性潛力分類方法不適用于氮亞硝基團位于芳香環(huán)內的N-亞硝基化合物(例如，亞硝化的吲哚)。對于含有2個亞硝化基團的NDSRIs，應使用預測致癌效力類別最高的組來確定整個分子的推薦AI限度。
該方法假設許多亞硝胺的致突變和高致癌反應是由代謝激活的α-羥基化機制引起的。因此，直接增加或減少激活機制有利的結構特征，或者通過其他生物途徑增加亞硝胺清除率的結構特征，都會對致癌活性產生相應的影響。
FDA基于NDSRIs的預測致癌效力分類方法，推薦了以下的AI限度。
▲表1- 五類預測致癌性效力分類及其對應的NDSRIs推薦Al限度
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效力類別
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推薦的AI(ng/天)
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說明
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1
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26.5
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建議的AI限值（26.5 ng/天*）等同于基于最強效且經過充分測試的亞硝胺類物質—N-亞硝基二乙胺（NDEA）的類別特定限值。此類別中的 NDSRIs被預測為具有不高于亞硝胺雜質類別特定限值的致癌活性。
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2
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100
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推薦的100ng/天的Al限度代表了兩種有效的，經過嚴格測試的亞硝胺，N-亞硝基二甲胺(NDMA)和4-(甲基亞硝胺)1-(3-吡啶基)-1-(丁酮)(NNK)，它們的推薦的Al限度分別為96ng/天和100ng/天。歸類為2類的NDSRIs的致癌效力預計不高于NDMA和NNK。
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3
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400
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此類別中的NDSRIs與類別2相比，致癌活性較低，例如，由于存在弱去激活結構特征。設定推薦的AI限度是為了反映致癌效力比第2類降低4倍的化合物。
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4
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1500
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此類別中的NDSRIs可能通過α-羥基化途徑進行代謝激活，但預計致癌活性較低，例如，由于該途徑受到空間或電子影響，或者由于優(yōu)先考慮清除途徑。根據ICH M7（R2）的毒性關注閾值（TTC），建議的AI限度為1500ng/天。
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5
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1500
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第5類的NDSRIs，由于空間位阻或缺乏a-氫，預計不會通過a-羥基化途徑代謝激活，或者預計形成不會和DNA反應的不穩(wěn)定的物質。根據ICH M7（R2）的TTC，推薦的Al限度為1500ng/天。
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對于在美國市場銷售的產品，即使其他監(jiān)管區(qū)域推薦不同的限度，FDA推薦類別1的AI限度為每天26.5納克。
▲圖3-預測NDSRI致癌性類別及確定相關推薦Al限度的流程圖（叔-α-碳定義為一個處于sp3雜化狀態(tài)的α-碳）
▲圖4-在NDSRI上的α-和β-碳原子結構
如上所述，推薦的AI限度適用于當在藥品中的單個NDSRIs，如果識別出超過一個（NDSRIs和小分子亞硝胺類雜質），并且檢測結果的總和超過了基于最嚴格的亞硝胺雜質推算出來的限度，就需要和FDA進行充分溝通（如果涉及藥物短缺的情況，更應該充分評估后采取適當的行動）。
關于如何對亞硝胺雜質的效力進行評分，可以采用以下方法：
▲表2-每個α-碳上氫原子的數量（數量少的排在前面）及相應的α-氫評分。每個α-碳上氫原子的數量，從最少的開始例子=a-氫評分0,2
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每個α-碳上氫原子的數量，從最少的開始
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例子
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=a-氫評分
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0,2
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0,3
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2
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1,2
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3
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1,3
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3
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2,2
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1
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2,3
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1
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備注：示例僅用于說明，并非詳盡無遺。
＄甲基α-碳不是乙基部分的一部分時，評分為3分。如果甲基α-碳是乙基部分的一部分，則應評分為2分。
▲表3-無活性特征列表及關聯(lián)評分
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無活性的特性
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例子
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單個無活性特征評分
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分子上任意位置的羧基
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+3
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吡咯烷環(huán)上的N-亞硝基
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+3
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含有至少一個硫原子的六元環(huán)中的N-亞硝基
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+3
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五元或六元環(huán)上的N-亞硝基*
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+2
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嗎啉環(huán)上的N-亞硝基
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+1
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七元環(huán)上的N-亞硝基
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+1
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無環(huán)N-亞硝基兩側連續(xù)的5個非氫原子鏈（環(huán)或無環(huán)）。每個環(huán)上不超過4個原子即可在同一條鏈上
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+1
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吸電子集團**僅與N-亞硝基團的α-碳原子相連（無論環(huán)狀或非環(huán)狀）
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+1
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吸電子集團**與N-亞硝基團兩側的α-碳原子相連（無論環(huán)狀或非環(huán)狀）
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+2
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羥基連接到N-亞硝基團單側的β-碳原子***上（無論是環(huán)狀還是非環(huán)狀）
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+1
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羥基連接到N-亞硝基團兩側的β-碳原子***上（無論是環(huán)狀還是非環(huán)狀）
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+2
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為了計算無活性特征評分，需要對NDSRI結構中列出的所有存在的無激活特征進行單個評分的總和。表格中的每個無激活特征行只能被計算一次。對于NDSRIs的N硝基基團位于多個環(huán)內的情況，應僅應用與最小匹配環(huán)對應的特征評分。示例旨在說明，并非詳盡無遺。
*排除了N-亞硝胺基位于吡咯環(huán)、包含至少一個硫原子的六元環(huán)或嗎啉環(huán)（分別計數）的情況。
**排除了羧酸（單獨計數）和酮（數據沖突）、以及芳基（單獨計數）。額外吸電子基團示例僅限于Cross KP和Ponting DJ在2021年發(fā)表于Comput Toxicol期刊上的（N-亞硝胺活性的結構-活性關系的發(fā)展）一文中描述的“β-碳吸電子基團”。
***β-碳電子必須處于sp3雜化狀態(tài)（碳原子通過單鍵與其他原子相連），以便此特性適用。
▲表4-有活性特征列表及關聯(lián)評分。
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有活性的部分
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例子
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單個有活性部分得分
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與α-碳鍵合的芳基（即N-亞硝基上的苯基或偽苯基取代基）
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-1
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與β-碳鍵合的甲基（環(huán)或無環(huán)）
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-1
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計算有活性的特征評分，需對NDSRI結構中列出的所有存在的有活性特征的單個評分進行求和。表格中的每個有活性特征行僅能計數一次。示例旨在說明性使用，并非詳盡無遺。
以下是示例1，如何應用預測致癌活性分類方法流程圖（圖1）到假設的NDSRIs，N-亞硝基-1-奈必洛爾。計算得出N-亞硝基-1-奈必洛爾的分數為4，因此將其歸類為類別4，并與每日推薦可接受攝入量限度1500ng相關聯(lián)。
例1：N-亞硝基-1-奈必洛爾
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α-氫的計數
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分數
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紅色突出顯示的功能
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2,2
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1
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去活化特性
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分數
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紅色突出顯示的功能
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N-亞硝基兩側與β-碳***鍵合的羥基（環(huán)或無環(huán)）
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+2
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在無環(huán)硝基的兩側有≥5個連續(xù)的非氫原子鏈（環(huán)或無環(huán)）。每條鏈上不超過4個原子可在同一環(huán)上
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+1
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不存在活性特征
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效力值=1+2+1=4
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效力等級4
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AI=1500ng/天
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***β-碳必須處于sp3雜化狀態(tài)，以便此特性適用
以下是示例2，展示了預測致癌性毒力分類方法流程圖（圖1）如何應用于假設的NDSRIs，N-亞硝基氯酮胺。N-亞硝基氯胺酮被歸類為類別5，與之關聯(lián)的推薦可接受攝入量限度為每天1500 ng。
例2：N-亞硝基氯胺酮
3.2 確定特定亞硝胺的AI限度的其他方法可以基于數據庫和文獻搜索可用的致癌性和細菌致突變數據，或使用特定化合物進行體內和/或體外測試。
FDA網站上也收錄了一些化合物的AI推薦值，詳見https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/cder-nitrosamine-impurity-acceptable-intake-limits。
▲圖5-FDA官網推薦的亞酰胺雜質AI限度（僅示例）
除FDA官網外，也可以通過the Carcinogenicity Potency Database（CPDB）或者the Lhasa Carcinogenicity Database（LCDB）這兩大數據庫查詢亞硝胺雜質的TD50。化合物特異性 AI 限度可基于嚙齒動物致癌性效力數據計算，例如在公開文獻中確定的導致50%腫瘤發(fā)生率的劑量（TD50 值）。導致50%腫瘤發(fā)生率的劑量相當于1:2的癌癥風險概率水平。
AI限度可以通過以下公式進行計算（50kg為人體體重）：
以下以N-亞硝基二甲胺（NDMA）為例說明AI限度的推導過程。NDMA在幾種物種中被確定為致突變致癌物，并被美國環(huán)境保護署的綜合風險信息系統(tǒng)計劃列為可能或疑似人類致癌物。根據致癌性效力數據庫，NDMA的TD50值為0.0959 mg/kg/天（大鼠）和0.189 mg/kg/天（小鼠）。對于AI限度計算，使用大鼠的較低值（更保守）。與1:100,000癌癥風險相關的AI限度（在70年暴露期內）通過將TD50除以50000然后乘以50（考慮50 kg體重的患者）計算得出，結果為0.0000959mg/天的NDMA，約為96ng/天的NDMA。因此，每日終身攝入96ng /天的NDMA對應于理論癌癥風險，因此在作為雜質存在時可以代表AI限度。
當一種雜質如ICH M7（R2）附錄中所述的致癌性研究數據不可用或質量較差時，FDA推薦使用預測致癌效力分類方法確定AI限度。
3.3 可以使用具有可靠致癌性數據的結構相似替代物進行的交叉分析，這種可替代物要求結合和反應性上與被替代物類似（取代的程度、空間位阻、電子效應、代謝激活的可能性以及生成的代謝物的穩(wěn)定性、反應性和整體的分子量），并且要求有可靠的致癌數據可用。
① 基于替代物的再交叉評估：應遵循ICH M7(R2) 指南中關于預測致突變潛力的建議，可以執(zhí)行(定量) 結構-活性關系（Q）SAR分析。通常情況下，替代物應該選擇有穩(wěn)健的致突變性和致癌性數據的亞硝胺雜質，比如：NDMA，N-亞硝基哌啶(NPIP),4-(甲基亞硝基氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)，N-亞硝基吡咯啶(NPYR), 和N-亞硝基嗎啉（NMOR）。
② 若需進行致突變性評估，可進行細菌致突變性試驗。
3.4 如果以上三種方法都無法確定亞硝胺化合物的AI限度，建議使用26.5 ng/day作為AI限度。
3.5 當藥物產品中可能存在多種亞硝胺雜質時，可以使用一種替代的靈活AI限度方法來建立規(guī)范。
以下方法可用于建立小分子亞硝胺和亞硝胺類藥物雜質（NDSRIs）的規(guī)格限度。
當同一藥物產品中可能存在多種亞硝胺時，可使用靈活方法控制總亞硝胺雜質的水平，以滿足基于1:100000增加癌癥風險的推薦可接受攝入量（AI）限度。每個單獨的亞硝胺應計算為其AI限度的百分比，使得所有亞硝胺的總和不超過100%。總亞硝胺的計算如下：
其中Xi是每個單個亞硝胺i的含量[以百萬分之一（ppm）為單位]，AIi是每個亞硝胺的AI限度（以ppm為單位），n不超過3。
以下是一種藥物產品中多種亞硝胺雜質總推薦AI限度的靈活方法示例。藥物A的最大日劑量為80mg/天：
總亞硝胺是每個單個亞硝胺AI限度百分比的總和。不超過100%意味著理論癌癥風險不超過1:100,000。
如果提議的總亞硝胺限度方法不同于上述方法，或者在一種藥物產品中檢測到超過三種不同的亞硝胺，鼓勵制造商和申請人聯(lián)系 FDA。
04亞硝胺雜質控制的推薦三步緩解策略
4.1 先對API、上市產品以及已批準和待批申請產品中亞硝胺雜質進行風險評估。
4.2 當風險評估的結果顯示有可能存在亞硝胺雜質時，應當進行確認測試。（因為亞硝胺雜質一般情況下分子量比較低、有部分的揮發(fā)性、并且雜質的毒性比較高），故需要開發(fā)有高專屬性和高靈敏度的檢測方法。
4.3 可以對工藝等進行相應的變更，以減少亞硝胺雜質的產生。并向對應的監(jiān)管機構提交該變更。
一般而言，對亞酰胺雜質的評估不僅包括小分子亞硝胺內物質，也包含NDSRIs，如果檢測到NDSRIs水平高于推薦的AI限度，建議生產商和申請人制定控制策略或/和設計方法，將其控制在可接受水平。
05減輕藥物活性成分（API）中亞硝胺雜質的控制措施
一般情況下，在合成路線開發(fā)過程中優(yōu)化API的制造工藝設計，能夠盡可能的減少或者防止亞硝胺雜質的形成。包含以下措施：
5.1 盡可能避免可能產生亞硝胺雜質的反應條件。
5.2 如果合成工藝路線中有可能形成亞硝胺的話，就盡可能使用除二級胺、三級胺或四級胺之外的堿，也盡量避免使用酰胺類的溶劑（N.N-二甲基甲酰胺，N,N-二甲基乙酰胺或者是N-甲基吡咯烷酮），在必須使用時，需要進行風險評估。
5.3 用其他的反應猝滅劑代替亞硝酸鹽用于疊氮化物的分解，若必須使用，可以考慮將疊氮化物先從反應混合物中分離出來，然后在不接觸API、中間體或者擬回收溶劑的情況下，用亞硝酸猝滅疊氮化物（例如反應物和疊氮化鈉可以通過有機相和水相分離的情況）
5.4 優(yōu)化并持續(xù)控制反應、工藝和反應條件（如pH值、溫度和反應時間）的順序。
5.5 設計能在后續(xù)加工步驟中清除亞硝胺雜質的工藝步驟。
5.6 對反應中涉及的起始物料、中間體、回收材料和水中的亞硝胺雜質均應該進行評估。
對于亞硝胺雜質檢測結果高于限度10%的藥物活性成分，制造商在放行時應該進行每批檢測；對于超過限度的藥物活性成分，不允許分銷。
06減輕藥物產品中亞硝胺雜質的控制措施
6.1 選擇可靠的藥物活性成分的供應商。關注藥物活性成分的合成工藝路線，關注多批藥物活性成分中的亞硝胺雜質的檢測結果。
6.2 對藥物產品，建立恰當的亞硝胺雜質的控制規(guī)范。
◆ 對于檢測結果超過限度的10%的時候，就應對藥物產品中的亞硝胺雜質進行檢測（包括穩(wěn)定性留樣的藥物產品）。
◆ 當由于API結構、API 合成工藝路線或制造工藝而存在顯著的亞硝胺形成風險時，也建議采用控制策略。
◆ 對于有檢出，但是未超過規(guī)定限度的10%的藥物產品，需要對驗證批次和對監(jiān)管批次進行亞硝胺雜質的檢測。當其制造過程、輔料、API或者其他關鍵要素發(fā)生變更，可能導致產品生命周期中亞硝胺形成時，也需進行檢測。
◆ 超過控制限度的藥物產品，在原則上不允許用于分銷。
6.3 盡可能對產品處方或者生產工藝進行優(yōu)化，以減少或預防產品中的NDSRIs形成。
◆ 對輔料進行篩選，選擇不含亞硝酸鹽或者含亞硝酸鹽但是含量低的輔料，降低輔料引入亞硝酸鹽的風險。
◆ 設計藥物產品時加入抗氧化劑[如抗壞血酸（維生素 C）、抗壞血酸鹽（如抗壞血酸鈉）、α-生育酚或沒食子酸丙酯]，少量加入會顯著抑制藥物產品中NDSRIs的形成。
◆ 修改產品處方的pH環(huán)境，從酸性變更為中性或偏堿性。（例如在處方中加入碳酸鈉）
07對于亞硝胺雜質測定結果的評估
◆ 若進行風險評估后，證明亞硝胺雜質不會在藥物產品或活性成分中存在，就可以不用進行確認性測試。
◆ 若無法完全說明亞硝胺雜質不存在，就需要進行確認性檢測（至少三個代表批次），檢測結果中，控制限度的10%是一個很關鍵的值，如果測定結果（含穩(wěn)定性數據）低于限度的10%，就可以不用在活性成分或者藥物產品中建立亞硝胺雜質的控制限度，對于已經批準的藥品，測定結果可在年報中匯報；若測定結果（含穩(wěn)定性數據）高于限度的10%，就需要建立產品的控制標準，并對放行及穩(wěn)定性產品進行檢測，對于已經獲批的產品，需要作為變更提交補充資料。
◆ 若檢測結果超過控制限度，就需要進行配方、制造工藝或者包裝的變更，來減緩相應的亞硝胺雜質的產生。如果有制造商或供應商有更合理的限度設定，可以與FDA進行溝通。
注：亞硝胺雜質的檢測方法也可在FDA網站上進行查閱。https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/cder-nitrosamine-impurity-acceptable-intake-limits
