摘 要： 建立正交試驗結合化學計量學對“柴胡-桂枝-生姜”中藥組合提取工藝的優化方法。采用高效液相色譜法同時測定“柴胡-桂枝-生姜”中藥組合中柴胡皂苷A、桂皮醛、6-姜辣素的含量，并通過L9（34）正交試驗結合主成分分析法優化該中藥組合的乙醇提取工藝。3種成分在考察濃度內與色譜峰面積的線性關系良好，相關系數均大于0.999，檢出限為0.001 4～0.904 1 mg/mL。平均回收率為97.72%～101.62%，測定結果的相對標準偏差為0.41%～1.01%（n=6）。最終確定優化提取工藝參數為6倍量70%乙醇提取3次，每次1.5 h。所得提取工藝有較好的可行性與可控性，可適用于工業化生產，為含揮發性成分的經典名方開發提供實驗參考。

關鍵詞： 高效液相色譜法； 揮發性成分； 正交試驗； 主成分分析； 乙醇提取工藝

中藥中的揮發性成分是由萜類、苯丙素類、脂肪酸類等成分組成的油狀物，是中藥辛味的重要藥性物質基礎[1-2]。辛味中藥（含揮發性成分中藥）具有散、行、潤、燥等功效，在表證和氣血阻滯等中醫病證治療方面應用廣泛[3]。在國家中醫藥管理局發布的《古代經典名方目錄（第一批）》中有83%的經典名方含具有揮發性成分的中藥[3]。傳統湯劑主要以水煎煮為主，通過控制煎煮順序、芳香氣味強弱等方式保證辛味中藥的揮發油提取率。而傳統煎煮往往容易造成揮發油損失[4]，難以保證辛味中藥的療效及質量穩定性[5-6]。現代工藝研究表明，采用乙醇提取可有效提高揮發性成分的提取率[7]，對中藥制劑的質量控制和療效保障具有重要意義。“柴胡-桂枝-生姜”是柴胡桂枝湯、柴胡加龍骨牡蠣湯和柴苓湯等經典名方中常見的辛味藥組合，其比例多為12∶4.5∶4.5。柴胡和解表里、疏肝升陽，桂枝發汗解肌、溫通經脈、助陽化氣，生姜解表散寒、溫中止嘔、溫肺止咳，三藥合用共奏解表清熱，調和表里之效[8?10]。該中藥組合中的揮發性成分為重要的活性成分，在制劑中發揮著重要作用。前期藥理研究表明，其揮發性成分通過調節炎癥因子水平減輕H1N1誘導的小鼠肺炎[11]。此外，中藥組合中的其他主要成分例如柴胡皂苷A、桂皮醛等在抗炎、抗病毒等方面均有良好的效果[12-13]。筆者建立了高效液相色譜法同時測定中藥組合中柴胡皂苷A、桂皮醛、6-姜辣素含量的方法，并通過L9（34）正交試驗結合主成分分析法優化中藥組合乙醇提取主要藥效成分的提取工藝參數[14]，以期為柴胡桂枝湯、柴胡加龍骨牡蠣湯等含揮發性成分中藥的經典名方研究開發提供參考。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Agilent 1260型，美國安捷倫科技有限公司。電子天平：CPA225D型，感量為0.01 mg，德國賽多利斯公司。數控超聲波清洗器：KQ-500DE型，昆山市超聲儀器有限公司。電熱鼓風干燥箱：FXB101-2型，上海樹立儀器儀表有限公司。低溫循環（真空）泵：DLSB-ZC型，鄭州長城科工貿有限公司。LCD數顯加熱型圓盤磁力攪拌器：MS-H-ProT型，大龍興創實驗儀器（北京）股份公司。柴胡皂苷A、桂皮醛、6-姜辣素對照品：純度（質量分數）均為98%，批號分別為B20146、B21081、B21838，上海源葉生物科技有限公司。乙腈、甲醇：均為色譜純，美國賽默飛世爾科技有限公司。中藥樣品：柴胡飲片產地為山東，批號為230301；桂枝飲片產地為廣東，批號為230102，均購自山東百味堂中藥飲片有限公司。生姜：市售。實驗所用其他試劑均為分析純。實驗用水為娃哈哈純凈水。

1.2 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，美國安捷倫科技有限公司）；柱溫：30 °C；檢測波長：柴胡皂苷A為210 nm，桂皮醛為290 nm，6-姜辣素為225 nm；進樣體積：25 μL；流動相：A相為乙腈，B相為水，流量為1.0 mL/min；洗脫方式：梯度洗脫，洗脫程序為0～18 min 32% 乙腈，18～27 min 32%～38% 乙腈，27～41 min，38% 乙腈。

1.3 樣品溶液制備

對照品溶液：分別取柴胡皂苷A對照品、桂皮醛對照品、6-姜辣素對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，制得質量濃度分別為1.146、4.601、0.414 mg/mL的對照品貯備溶液。樣品溶液：按照柴胡12 g、桂枝4.5 g、生姜4.5 g稱取藥材，加入6倍量70%乙醇加熱回流提取1 h，過0.22 μm濾膜，取續濾液，即得。陰性對照溶液：“柴胡-桂枝-生姜”組合分別減去柴胡、桂枝、生姜單味藥材，采用樣品相同的制備方法，制備陰性對照溶液。空白溶液：取70%乙醇過0.22 μm濾膜，取續濾液，即得。

1.4 實驗方法

取樣品溶液及對照品溶液，按照1.2儀器工作條件測定，以色譜峰面積外標法對柴胡皂苷A、桂皮醛、6-姜辣素進行定量，然后通過L9（34）正交試驗結合主成分分析，綜合評價最佳提取工藝。

2 結果與討論

2.1 色譜條件選擇

參考《中華人民共和國藥典》（2020版）一部“柴胡”“桂枝”以及“生姜”的含量測定方法進行優化[15]，分別選用乙腈-水溶液、乙腈-0.1% 甲酸水溶液、乙腈-0.1% 磷酸溶液為流動相對柴胡皂苷A、桂皮醛、6-姜辣素進行考察。結果表明，采用乙腈-水溶液流動相體系，對3種成分的色譜分離度良好且穩定性強。將照品溶液在190～400 nm波長下進行全波長掃描，結果表明，3種成分分別在210、290、225 nm下有較強吸收且分離度較好。將柱溫分別設置為25、30、35 ℃進行試驗。結果表明，相比在25、35 °C，當溫度為30 ℃時，色譜峰基線平穩且柴胡皂苷A、桂皮醛、6-姜辣素的色譜峰分離度良好。

2.2 線性方程與檢出限

取質量濃度分別為1.146、4.601、0.414 mg/mL的柴胡皂苷A、桂皮醛、6-姜辣素對照品溶液，逐級稀釋，得到系列標準工作溶液，按照1.2儀器工作條件進行分析，以目標物的質量濃度（x）為橫坐標，色譜峰面積（y）為縱坐標，繪制標準工作曲線。以3倍信噪比時對應的溶液中柴胡皂苷 A、桂皮醛、6-姜辣素的質量濃度作為方法檢出限和定量限。3 種目標物的質量濃度線性范圍、線性方程、相關系數及檢出限見表1。由表1可知，3種成分在考察濃度內與色譜峰面積的線性關系良好，相關系數均大于0.999，方法檢出限為0.001 4~0.904 1 mg/mL，表明該方法具有良好的靈敏度，適于定量。

表1   線性范圍、線性方程、相關系數及檢出限Tab. 1   Linear range, linear equation, correlation coefficient, and detection limit

2.3 方法專屬性

分別精密吸取混合對照品溶液、樣品溶液、缺柴胡陰性溶液、缺桂枝陰性溶液、缺生姜陰性溶液及空白樣品溶液，在1.2儀器工作條件下進樣分析，色譜圖如圖1所示。從圖1中可以看出，空白樣品溶液及陰性溶液中的成分對樣品溶液中3種成分的測定無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1   色譜圖Fig. 1   chromatograms

1—桂皮醛；2—柴胡皂苷A； 3—6-姜辣素

2.4 穩定性試驗

按照1.3方法制備樣品溶液，然后在第0、2、4、6、12、24 h時，按1.2儀器工作條件進樣分析，記錄對應色譜峰面積，計算峰面積的相對標準偏差，試驗結果見表2。由表2可知，樣品溶液在24 h內有較好的穩定性。

表2   穩定性試驗結果Tab. 2   Stability test results

2.5 精密度試驗

按1.3方法平行制備6份樣品溶液，在1.2儀器工作條件下進樣分析，記錄對應色譜峰面積，并計算峰面積的相對標準偏差，結果見表3。由表3可知，測定結果的相對標準偏差為0.41%~1.01%，表明該方法精密度良好。

表3   精密度試驗結果Tab. 3   Precision test results

2.6 樣品加標回收試驗

精密量取樣品溶液0.5 mL于2 mL容量瓶中，精密加入0.5 mL混合對照品溶液（其中柴胡皂苷A、桂皮醛、6-姜辣素的質量濃度分別為0.433 3、0.473 0、0.047 2 mg/mL），用甲醇定容，搖勻，濾過，在1.2儀器工作條件下測定，試驗結果見表4。

表4   樣品加標回收試驗結果Tab. 4   Sample spiked recovery test results

由表4可知，實際樣品加標的平均回收率為97.72%～101.62%，表明該方法具有較高的準確度，符合分析要求。

2.7 提取工藝優化

2.7.1 正交試驗結果及分析以3種成分的綜合評分為評價指標，提取溶劑（70%乙醇）量（A）、提取時間（B）、提取次數（C）為3種考察因素，設計正交試驗對提取工藝進行優化。采用綜合加權評分法進行分析，按照下式計算綜合評分：綜合評分 = （柴胡皂苷A含量/最高柴胡皂苷A含量）× 0.35 +（桂皮醛含量/最高桂皮醛含量）× 0.35+ （6-姜辣素含量/最高6-姜辣素含量）× 0.3，正交試驗結果見表5，方差分析結果見表6。由表6可知，3種因素影響程度依次為C（提取次數）＞A（提取溶劑量）＞B（提取時間），各因素對提取效率均有顯著影響（P < 0.05），表明加入6倍量70%乙醇，提取3次，每次提取1.5 h的提取效率高。

表5   L9（34）正交試驗結果Tab. 5   L9 (34) Orthogonal test results

表6   方差分析結果Tab. 6   Results of analysis of variance

2.7.2 液相圖譜信息主成分分析中藥成分復雜多樣，為了進一步全面整體性評價“柴胡-桂枝-生姜”中藥組合的提取工藝，采用指紋圖譜結合主成分分析進行深入研究。“柴胡-桂枝-生姜”中藥組合高效液相色譜 3D光譜圖如圖2所示，“柴胡-桂枝-生姜”中藥組合于210 nm檢測波長的色譜圖如圖3所示。

圖2   “柴胡-桂枝-生姜”中藥組合HPLC 3D光譜圖

Fig. 2   HPLC 3D spectrum of "Chaihu-Guizhi-Ginger" traditional Chinese medicine combination

圖3   “柴胡-桂枝-生姜”組合于210 nm檢測波長的色譜圖

Fig. 3   Chromatogram of "Chaihu-Guizhi-Ginger" traditional Chinese medicine combination at a detection wavelength of 210 nm

1~18—共有特征色譜峰

從圖2、圖3中可以看出，在全波長掃描下，于210 nm波長處的色譜峰信息豐富，對其中的18個共有特征色譜峰進行積分處理，以色譜峰面積為指標進行主成分分析，結果顯示前5個主成分的累計貢獻率為91.076%，可用于“柴胡-桂枝-生姜”中藥組合的整體評價。各主成分的特征值、方差貢獻率、累計方差貢獻率及各主成分高載荷色譜峰[16]結果數據見表7。

表7   主成分的特征值、方差貢獻率、累計方差貢獻率及高載荷色譜峰

Tab. 7   Eigenvalues, variance contribution rates, and cumulative variance contribution rates of principal

將原始指標進行標準化處理，計算得5種主成分的得分，再根據各主成分的貢獻率，推導出主成分綜合評價線表達式為F=0.373 02Y1+0.221 63Y2+0.147 60Y3+0.099 15Y4+0.069 36Y5。根據表達式得出綜合得分，用于整體性評價提取工藝，結果見表8。由表8可知，5號工藝即6倍量70%乙醇提取3次，每次1.5 h，與正交試驗結果相同，說明從整體評價提取工藝與測定指標性成分柴胡皂苷A、桂皮醛、6-姜辣素的含量評價提取工藝可相互對應，使提取工藝更準確、可靠[17-18]，因此5號工藝為最佳工藝。

表8   主成分得分和綜合得分Tab. 8   Principal component scores and comprehensive scores

2.8 提取工藝驗證

依據篩選出的中藥組合最佳提取工藝參數，進行3批驗證性試驗。結果表明，柴胡皂苷A、桂皮醛、6-姜辣素含量的相對標準偏差分別為0.23%、0.63%、0.60%，表明優化方法準確、合理、可靠。使用該提取工藝制備的3批樣品中的各指標性成分含量穩定，且提取率較高，表明此工藝條件重復性好，穩定可行。

3 結論

建立了高效液相法同時測定“柴胡-桂枝-生姜”中藥組合中柴胡皂苷A、桂皮醛及6-姜辣素含量的方法，并對色譜條件進行了優化，適用于3種成分含量的同時測定。采用乙醇提取解決了揮發性成分在提取時油水分離困難、提取率較低等問題，并在此基礎上，通過指標性成分定量與色譜圖特征信息分析結合的方法對該中藥組合的乙醇提取工藝進行優化。采用正交試驗，以多個成分的含量為指標綜合評價提取工藝，使所得結果具有準確性和可靠性。同時結合主成分分析，選擇多個代表性綜合指標（主成分）代替原始變量，最大限度地保留樣本的原始信息并對樣本做出整體性評價，與中藥多成分、多靶點的特點相契合。最終優化提取工藝為6倍量70%乙醇提取三次，每次1.5 h。所建立的分析評價方法具有快速簡便、穩定性好、結果精確度高的特點，可為含有揮發性成分的經典方劑的進一步開發提供實驗基礎。

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