1. 平均分子量介紹

GPC的測定對象為聚合物，聚合物一般是在一定的反應條件下，由相同或者不同的單體形成的重復的、具有不同鏈長的高分子混合物，要對其進行測定，就需要引入平均分子量的概念。

圖1 聚合物的形態（體型也叫做交聯型）

根據統計方式的不同，可以將平均分子量分為數均分子量、重均分子量和Z均分子量等概念，其中，數均分子量和重均分子量比較常用。數均分子量通常與材料、拉力和抗沖擊性相關；重均分子量通常與脆度相關；Z均分子量一般和彈性和硬度相關。以下為各分子量的概念：

數均分子量：按照分子數目統計平均計算的分子量，稱為數均分子量，以（1）表示（是數量上的平均）。 (1)

重均分子量：按照單位質量統計平均計算的分子量，稱為重均分子量，以（2）表示（是質量上的平均）。 (2)

Z均分子量：基于聚合物中每個單元重復出現的次數計算的分均分子量，稱為Z均分子量，以（3）表示。 (3)

峰頂點分子量：為色譜峰頂點時，對應的分子量，以（4）表示。 (4)

多分散系數：多分散系數為重均分子量與數均分子量的比值，以D表示。

通常情況下，數均分子量＜峰頂點分子量＜重均分子量＜Z均分子量

下面，舉例說明數均分子量和重均分子量的計算：

①假設一個混合物中有5個分子，每個分子在數量上的占比均為1/5（也就是20%），他們的分子量分別為1000、2000、3000、4000和5000，那計算出的數均分子量為：

數均分子量=20%×1000+20%×2000+20%×3000+20%×4000+20%×5000=3000

②如果一個混合物中有3個分子，3個分子的分子量總重為10萬，他們的重量比例分別為3萬/10萬、2萬/10萬和5萬/10萬，也就是30%、20%和50%。

重均分子量=30%×3萬+20%×2萬+50%×5萬=3.8萬

2. 凝膠滲透色譜法（GPC）原理介紹

了解了上述的分子量的概念，就需要對GPC的原理進行介紹。GPC是主要是基于分子排阻的原理，在色譜柱中進行。固定相為凝膠態的多孔填料，分子樣品可以部分或全部進入到孔徑內部，根據溶劑化后的聚合物分子體積大小而先后排阻洗脫，洗脫時間與分子量大小一一對應。通常來講，分子量越大，洗脫時間越短，GPC分離不依靠樣品與固定相之間的相互作用力。

GPC是根據聚合物溶劑化后的大小在色譜柱上進行排阻的，如果聚合物溶劑化后的體積過大，就無法進行色譜柱的凝膠孔隙中進行排阻。如果溶劑化的聚合物大小剛剛能進入凝膠孔隙，此時對應的聚合物的分子量大小被稱為排阻限（排阻極限）。如果聚合物的體積很小，剛剛能從色譜柱的凝膠孔隙中穿透出來，此時對應的聚合物的分子量大小被稱為滲透限（滲透極限）。2個限值表明了色譜柱可分析的分子量的范圍。

圖2 分子量大小與保留時間的關系

分子量大的聚合物在色譜柱中的排阻距離小，出峰時間早。分子量小的聚合物在色譜柱內的排阻距離大，出峰時間比較晚。

3. 凝膠滲透色譜法（GPC）測定分子量的設備組成

GPC測定分子量的設備組成與常規的液相系統相似，檢測器一般為示差檢測器（若待測物有紫外吸收，也可選擇紫外檢測器），軟件部分需要配備相應的GPC數據分析軟件。

4. 凝膠滲透色譜法（GPC）分析要點

GPC的分析步驟常見如下：

首先：根據樣品特點選擇1）溶解溶劑和流動相，2）色譜柱種類，3）色譜柱的大小和規格，4）標準品的類型和分子量大小，5）校正方法

其次：配制標樣和樣品，上機測試，得到合適的色譜圖

最后：進行數據處理，用GPC軟件分析獲得的數據

4.1 溶解溶劑/流動相的選擇

4.1.1溶劑（流動相）類型：通常溶劑的選擇是根據樣品的特性選擇的，依據相似相溶的原理，通常能溶解，即可用于測定。通常選擇低黏度和低沸點的溶劑，要求能充分溶解樣品且不會與色譜柱的固定相發生互溶，常見的GPC使用溶劑有四氫呋喃、氯仿、二甲基亞砜和水等，四氫呋喃是很多塑料的良溶劑。

4.1.2純度要求：一般要求溶劑的純度在HPLC級別及以上，要求必須進行本底溶劑測試，觀察是否會在標準品和樣品的出峰位置出現干擾峰，影響樣品的檢測。

4.1.3緩沖鹽的濃度和純度：有時需在溶劑或流動相中加入鹽試劑，比如在水中加入硝酸鈉鹽，在DMF中加入溴化鋰鹽。隨著鹽濃度的增加，聚合物分子狀態從伸展構象變成無規線團（無規線團是最接近聚合物分子最真實的狀態），且緩沖鹽可以減少分子所帶的靜電荷，減弱離子包容和離子排斥作用對分子量測定產生的影響。但鹽濃度過大，也會對色譜系統產生一些負面影響，導致色譜柱的壓力增加、柱效降低且會較快地縮短色譜柱的壽命，故水相中鹽濃度通常在0.1-0.5mol/L之間，DMF中通常小于20mmol/L。

4.1.4樣品的溶劑：最好選擇流動相溶解樣品，如果不能，需要與流動相類似，并可以互溶。

4.1.5 注意事項：

流動相更換時，互溶性較差，就需要中間溶劑進行過渡。

需要選擇與檢測器匹配的流動相（如果是紫外檢測器，要注意流動相的末端吸收）。

流動相需要脫氣后，才能正常使用。

盡可能避免使用含有鹵素離子的緩沖液，因鹵素離子會腐蝕不銹鋼系統。

如果使用高濃度的四氫呋喃、二甲基亞砜等溶劑作為流動相，需要匹配能耐受的管路。

4.2 色譜柱的選擇

4.2.1根據樣品所使用的溶劑和流動相選擇色譜柱的類別，同時需要與標準品匹配

4.2.2 除了溶劑之外，還需要根據樣品分子量范圍來選擇色譜柱的規格，樣品分子量應處于排阻限和滲透限范圍內，且最好處在校正曲線范圍內。

4.2.3 色譜柱的分類：

普通凝膠柱：相對于混合凝膠柱在一段時間內校正曲線呈線性

混合凝膠柱：在比較寬的范圍內都呈現線性

4.2.4 色譜柱的安裝：

有時為了擴大測定的分子量的范圍，可以將色譜柱串聯，一般串聯的時候需要將排阻限大的色譜柱接在前面，通常而言，分析結果與色譜柱安裝的順序沒有太大的關系，將排阻限大的色譜柱安裝在之前，是因為色譜柱的孔徑越大，對外來污染物的承受能力就越強。

串聯安裝時，還需要考慮色譜柱的壓力耐受范圍，設置的最大壓力應該根據耐壓能力較低的色譜柱來設定。

4.2.4 色譜柱選擇的注意事項：

色譜柱的分子量排阻限與樣品或標準品的分子量不匹配時，就會出現異常情況。

聚合物的分子量應該均勻地落在色譜柱組的線性范圍內，高分子量端平穩抬起，低分子量端平穩下降。

如果凝膠柱組孔徑過大，小孔徑的填料不足，就會出現分子中小分子組份與晚出峰的聚合物部分重疊。

如果凝膠柱組孔徑過小，大孔徑的填料不夠，就會出現高分子量端有隆起現象，且出峰時間靠前。

4.3  標準品的選擇

4.3.1 標準品的選擇是根據樣品的溶解溶劑來選擇的，一類溶解在水中，采用水相作為流動相，叫做水溶性樣品；另外一類溶解在有機溶劑中，采用有機溶劑作為流動相，叫做油溶性樣品。

4.3.2常見的標準品

聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA，常溶解于有機溶劑中）

聚苯乙烯（PS，最為普遍，溶解于各種的有機溶劑中）

聚乙二醇（PEG，溶解于有機溶劑和水中）

聚環氧乙烷（PEO，又被稱為氧化乙烯，可以溶解于有機溶劑及水中）

普魯蘭（溶于水中）

葡聚糖（溶于水中）

蛋白質（溶于水中）

具體的各種溶劑和其對應溶解的標準品如下表所示

4.3.3 標準品的配制及其注意事項

配制標準品時，為節約分析時間，可以將根據標準品的分子量高低，兩兩分組（需確認色譜峰能完全分離）。（例如：將分子量從高到低排序分為1~6，那么3和6一起配制，2和5一起配制，1和4一起配制）

至少選擇5個標準點樣品

進樣前，需要采用0.45μm的濾膜過濾

進樣體積在20~100μl之間

標準品溶解的時候，不能加熱，也不能振蕩超聲，需要靜置溶解（快速溶解的樣品，會導致分子量較大的化合物的鍵斷裂，導致測定結果的異常）

綜合來講，在保證樣品的基本信號強度可以識別的情況下，聚合物溶液的濃度越稀越好。因為分子量越大的化合物，濃度增加的越快，半峰寬展開的也比較快，峰就越寬。且分子量越大的化合物，濃度越高時，對保留時間也會有影響，洗脫體積越大，保留時間會被延長，導致最后測定的分子量比較偏小。

4.4 校正方法的選擇

常見的校正方法有兩種，窄分布校正法和普適校正法。

4.4.1 窄分布校正法

選擇與被測樣品結構相同或者相似的標準樣品（分散性D≤1.1），先用其他方法精準測定其相對平均分子質量，然后與被測樣品在相同的條件下進行GPC的分析。

主要用于無支鏈型分子量的校正，要求樣品最好與標樣是相同或者相近的結構。

①窄分布校正情況分類：

如果樣品與標樣的結構完全一致，就無需進行校正（例如采用聚乙二醇系列標樣測定聚乙二醇4000的平均分子量）。

如果樣品與標樣結構不一致，且樣品帶有支鏈，則無法用窄分布校正法。

如果樣品與標樣結構不一致，但是樣品是單鏈結構，則可以用QF因子比來修正結果。

②QF因子比定義與具體的計算方法

QF因子：指的是單位鏈長分子量（僅僅適用于單鏈聚合物）

QF因子比：樣品與標準品單位鏈長分子量的比值

校正時，在對應的GPC軟件處輸入QF因子比即可。

4.4.2 普適校正法

①普適校正法的原理

GPC反映的是淋洗體積與高聚物流體力學體積之間的關系，根據Flory-Fox的方程：

 （5）

其中，[?]為高分子的特性黏度，rg為根均方半徑，M為高分子的分子量，Φ為常數，將公式（5）變更，得到：

 （6）

其中，[?]M為線團體積的函數，我們記作ƒ（V），將Mark-Houwink方程（7）代入公式（6），得到方程（8）：

 （7）

 （8）

說明只要淋洗體積相同，不同分子量的KMα+1數值是一致的。大量的實踐也證明，具有相同淋洗體積的不同高分子流體力學體積相等[1]，假設用已知高分子的標準物質來測定未知物質，可以得到：

 （9）

式中，K，α是Mark-Houwink方程中的參數，下標1、2分別代表標準物質與待測高分子，若標準高分子的重均分子量M1與其K1和α1已知，且待測高聚物的K2，α2也可以得到，那就就可以根據上述公式測定得到待測高分子聚合物的真實分子量M2。

②普適校正法的注意事項

適用于有支鏈的化合物，但只有非離子型的高分子才可以用普適校正法

選用的溶劑一般是有機溶劑，常見的有四氫呋喃、鄰二甲苯、氯仿和甲苯

待測物和標準品的K值和α值均要求在相同條件下得到（可用粘度法測定得到，也可以查找高分子材料的工具書中得到）

當待測樣品在色譜柱的分離過程中存在除了分子排阻外的其他分離機理時，不適用。

4.4.3 計算

采用合適的校正方法，可以根據標準品的保留時間，輸入對照品的峰頂點分子量值，進行對數擬合，擬合出合適的校正曲線。運行樣品后，可以得出樣品的數均分子量、峰頂點分子量、重均分子量、Z均分子量和分子量分布。

4.5 其他

4.5.1 柱溫

適當升高柱溫，可以充分溶脹GPC色譜柱中的凝膠，讓聚合物分子的溶解度增加，減少色譜柱對聚合物分子的吸附，同時降低其黏度，增加擴散速度，提高柱效。一般來說，提高柱溫時，對小分子物質的測試效果的影響比較小，但對大分子物質的影響比較大。

柱溫也不可過高，容易造成凝膠的老化，且對色譜系統的影響也比較大，一般柱溫控制在30~50℃，對試驗結果的影響比較小。

某些聚合物在最低臨界溶解溫度以上時分子線團尺寸變大，測定該類對溫度敏感的聚合物，要求柱溫低于最低臨界溶解溫度，可有效避免線團變大帶來的影響[2]。

4.5.2 樣品濃度

上文我們提到，當樣品濃度過高，會阻礙分子的擴散，影響半峰寬和保留時間，甚至導致色譜柱的超載。同時，樣品濃度的選擇還應該考慮所用檢測器的靈敏度，濃度過低，檢測器的響應較弱，比較容易產生誤差。

在合適的濃度下，淋出體積（保留時間）與分子量大小呈線性關系，一般樣品的質量濃度在1~3mg/ml時得到的數據的重現性相對較好，測定分子量與分子量分布的準確度比較高。有時，配制濃度也可放寬至0.05~0.5%（質量分數）。

5. 影響GPC測定聚合物分子量大小的其他因素

5.1 在排阻色譜中存在的其他的相互作用

5.1.1 填料與樣品的相互作用

疏水性吸附作用：樣品可能被填料吸附，洗脫變慢，使得分子量的計算結果變小

排斥性作用：有可能存在離子排斥，靜電排斥等，被填料排斥，使得洗脫變慢，分子量的計算結果變大

5.1.2 樣品本身、不同樣品間的相互作用

聚合物分子內部離子排斥：聚合物內部包裹了金屬離子，使得聚合物分子變大，分子鏈變大，導致洗脫變快，分子量的計算結果變大。

聚合物分子之間的結合：使得分子量的測定結果變大。

5.1.3 判斷是否存在相互作用的一些方法

色譜峰的形狀也是重要的判斷標準，測試中色譜峰峰形對稱，呈正態分布（無拖尾和前沿）的，其吸附或者排次的可能性小。

不同進樣量的比值與不同進樣量下的峰面積的比值，兩個數值越接近，則相互作用越小。

同樣的進樣量下，不連接色譜柱和連接色譜柱的峰相應大小，兩個數值越接近，則流動相（淋洗液）越合理。

5.1.4 存在相互作用時，如何抑制和消除

關注標準品或樣品與色譜柱填料的匹配性

添加鹽、降低離子排斥作用，如氯化鈉、硝酸鈉、氯化鋰、溴化鋰、三氟乙酸鈉等等

可加入適量的甲醇或乙腈等強極性溶劑，抑制親水性相互作用

對于高分子量的樣品，在信號強度適當的前提下，降低樣品的濃度等

5.1.5 油溶性聚合物分子量的測定應用

分子中不含親水性片段的油溶性聚合物，一般將四氫呋喃作為流動相的首選，常見的有聚氟乙烯和聚苯乙烯。若分子中存在親水性基團（如端基或者支鏈中含有羧基），但該基團對整個高聚物的淋出體積影響較小，也可以用四氫呋喃直接測定。如果影響較大，就需要加入一定抑制劑，減弱相互作用。如，加入10%的乙酸的四氫呋喃作為苯乙烯和衣康酸共聚物測定的淋洗液。[1]

研究發現，直接用四氫呋喃作為淋洗液，測定一些含氮原子的高聚物的分子量，可能會比較困難，這就可以在淋洗液中加入適量的含氮小分子，可以抑制固定相的吸附作用，達到滿意的效果。

在非極性高聚物分子量的測定過程中，除了可以加入適量醋酸外，還可以往四氫呋喃中混合其他強極性的溶劑作為淋洗液，如甲醇和乙腈等。但是加入強極性溶劑后，需要平衡待測物的溶解度與溶質的優先溶劑化的關系。

有時也可以采用衍生的方法，當強極性基團存在于高分子鏈上而不能直接測定時，可用衍生化方法處理。

5.1.6水溶性聚合物分子量的測定應用

影響水溶性聚合物淋洗體積的主要因素有氫鍵、帶電荷的離子包容、離子排斥和疏水相互作用。

當氫鍵相互作用較為嚴重時，樣品的淋洗體積大于溶劑淋洗體積（出峰在溶劑峰之后），無法得到測定結果，因此，可以在淋洗液中加入適量的尿素、乙二醇、低分子量的聚乙二醇等，抑制氫鍵的相互作用。

離子包容和離子排斥作用對分子量的測定也有一定的影響。當高分子電解質的凈電荷不為零時，易同色譜柱所帶的電荷發生相互作用。離子包容使得分子量的測定值偏低，離子排斥使得測定值偏高。提高淋洗液的離子強度可以減弱這兩種因素對分子量測定的影響。調節淋洗液的pH、加入適量的鹽可以都可以減少或消除離子作用。

此外，當高分子溶質和GPC色譜柱的填料之間存在較強的疏水作用時，被測高分子聚合物就無法或者難以進入適當大小的凝膠孔中，導致淋出體積偏小，測定的結果偏高。根據不同的高分子類型，可以在水溶性的淋洗液中添加適當的乙腈、甲醇或者四氫呋喃來消除這種疏水相互作用。

5.2 標準品帶來的差異

選擇適當的標準品，也是測定平均分子量結果準確可靠的因素之一。故在方法中，一定要明確所選擇的標準品的種類。

5.3 檢測系統的影響

溶劑替換：溶劑需要替換完全，如果兩種溶劑不相容，就得選擇第三種溶劑進行替換。

系統沖洗：用過緩沖液的系統，若長時間停用，需用水或有機溶劑沖洗系統和色譜柱，最后用四氫呋喃或甲醇或其他有機溶劑充滿各個管路。

RID平衡操作：需要反復平衡流通池和參比池，直至兩者完全平衡，注意需要信號歸零。

色譜柱也需要平衡到位，使得壓力穩定。

若系統平衡不充分，就易帶入氣泡，產生倒峰。

5.4 保留時間穩定（溫度、儀器狀態等）

保留時間與分子量的對數呈現線性關系，保留時間的波動對測定結果的影響非常大。為了維持保留時間的恒定，除了需要對淋洗液進行脫氣處理外，還需要維持溫度和儀器狀態的穩定。

環境溫度通常維持在25℃；柱溫箱溫度一般在30~50℃，通常設置為40℃；分析期間柱溫箱門必須關閉。檢測器溫度與柱溫箱溫度相同，分析期間檢測器門窗必須關閉。且檢測器放置的位置需要避開空調的出風口。

5.5 校正曲線的有效性

因標準品的成本較高，有些情況下不會在運行樣品時隨行進樣標準品。若未進行隨行標曲，就需要每周用標樣評價標準曲線，如果偏差大于0.10M，就需重新進行標準曲線的檢測。

更換或添加色譜柱，需要重新做標準曲線。

測試條件有任何的改變（如溫度、流速等），均需重新建立標準曲線。

參考文獻：

[1]丁生龍，從勇，高春梅，劉明珠.凝膠滲透色譜在高聚物分子量測定中的應用。

[2] 段英慧.聚合物分子量測定方法的進展。

[3] USP:2.2.30. Size-exclusion chromatography

[4]《中國藥典》0514 分子排阻色譜法