引言

在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，骨缺損修復(fù)是一個(gè)長期困擾患者和醫(yī)生的難題，尤其是那些因腫瘤切除、感染、外傷等造成的超過一定大小無法自然愈合的缺損，往往需要復(fù)雜的治療方法。傳統(tǒng)的治療方法往往效果有限，且存在諸多局限性。然而，隨著科技的進(jìn)步，一種新的方法正在為這一難題提供解決方案——利用純天然絲素蛋白（SF）通過冷凍鑄造技術(shù)制成具有皮質(zhì)骨樣層狀結(jié)構(gòu)的3D支架。展現(xiàn)出了強(qiáng)大的修復(fù)大型骨缺損的能力，甚至無需添加生長因子，就能在豬模型上實(shí)現(xiàn)骨再生，這項(xiàng)技術(shù)或?qū)⒊蔀楣侨睋p患者的福音！近期，相關(guān)工作以題為“Oriented Cortical-Bone-Like Silk Protein Lamellae Effectively Repair Large Segmental Bone Defects in Pigs”的文章發(fā)表在材料領(lǐng)域知名期刊《Advanced Materials》。

靈感來源于大自然的設(shè)計(jì)

當(dāng)骨缺損超過臨界大小時(shí)（如嚴(yán)重車禍或腫瘤切除后），骨組織無法自然愈合，形成大段骨缺損（LSBD）。LSBD的修復(fù)是骨科手術(shù)中的一個(gè)重大挑戰(zhàn)，因?yàn)楝F(xiàn)有的治療方法，如自體或異體骨移植、牽張成骨和骨膜誘導(dǎo)成骨等，都存在一定的局限性。這些方法可能面臨來源有限、需要多次手術(shù)、增加手術(shù)創(chuàng)傷和疼痛以及嚴(yán)重免疫排斥風(fēng)險(xiǎn)等問題。組織工程療法作為一種新興的治療手段，利用人工3D生物材料模擬細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的性質(zhì)，為骨缺損修復(fù)提供了新的思路。然而，這些材料的孔隙連通性差，與天然骨組織的微結(jié)構(gòu)差異顯著，導(dǎo)致細(xì)胞招募、血管化、體內(nèi)降解和成骨誘導(dǎo)不足。因此，開發(fā)一種具有天然骨組織類似微結(jié)構(gòu)的3D支架，成為骨組織工程領(lǐng)域的一個(gè)重要研究方向。

研究團(tuán)隊(duì)使用全蠶絲蛋白——從蠶繭中提取的SF，通過冷凍鑄造技術(shù)一體化構(gòu)筑骨修復(fù)支架材料，具有皮質(zhì)骨類似的層狀結(jié)構(gòu)，模仿了人體骨骼中的哈弗斯系統(tǒng)，該系統(tǒng)由多層平行排列的骨板構(gòu)成，能夠在體外為細(xì)胞的生長和骨組織的再生創(chuàng)造了絕佳條件。研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，使用絲素蛋白制備的層狀支架不僅具有良好的機(jī)械強(qiáng)度，可承受負(fù)重部位的力學(xué)需求，還能夠促進(jìn)組織再生細(xì)胞（如間充質(zhì)干細(xì)胞[MSCs]和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞[hUVECs]）的附著、遷移和增殖，成為研究骨類器官的有力工具。更重要的是，在沒有添加生長因子的情況下，這些支架也能顯著加速新血管形成，并將巨噬細(xì)胞從促炎M1型轉(zhuǎn)變?yōu)榭寡譓2型，從而促進(jìn)骨再生（圖1）。

圖1 用于體外3D細(xì)胞培養(yǎng)和體內(nèi)LSBD修復(fù)的SF層狀支架的構(gòu)建；a) 通過冷凍鑄造儀器制備具有類骨層狀結(jié)構(gòu)的SF支架，該儀器包括液氮箱、加熱線圈、銅棒和溫度控制系統(tǒng)；b) 在SF層狀支架中接種MSCs后，MSCs在層狀表面粘附、遷移和增殖；c) 將接種MSCs的支架植入小型豬模型的LSBD模型中；d) 植入后早期，SF層狀支架在體內(nèi)募集炎癥細(xì)胞并促進(jìn)血管再生；e) 植入后期，支架的持續(xù)降解和成骨-血管生成耦合促進(jìn)新骨的再生和骨基質(zhì)成熟

1. SF層狀支架的特性

研究人員首先對比了由傳統(tǒng)冷凍干燥法制備的蜂窩狀多孔（HP）支架與采用冷凍鑄造法制備的單向?qū)訝疃嗫祝↙P）結(jié)構(gòu)SF支架。掃描電鏡觀察顯示，所有SF冷凍鑄造支架表面和內(nèi)部均呈現(xiàn)出均勻的層狀結(jié)構(gòu)，與天然皮質(zhì)骨的微觀結(jié)構(gòu)高度相似，層厚隨SF濃度增加而增加，從6%到22%，層厚從0.9微米增加到3.8微米。這表明，通過調(diào)整SF濃度，可以有效控制支架的微觀結(jié)構(gòu)及其機(jī)械性能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，所有LP支架在相同SF濃度下的彈性模量和壓縮應(yīng)力在片層結(jié)構(gòu)冰晶生長的長軸方向上均高于HP支架。這意味著，通過冷凍鑄造技術(shù)制造出的具有均勻?qū)訝罱Y(jié)構(gòu)的SF支架不僅具備較高的機(jī)械強(qiáng)度，而且其力學(xué)性能接近宿主骨，適合用于承重部位的骨組織工程，有助于恢復(fù)骨組織的正常功能。研究還評估了不同SF支架在生理環(huán)境下的降解率。有趣的是，LP支架的降解速度比HP支架更快，這為骨缺損修復(fù)提供了更合適的時(shí)間窗口。適中的降解速率有助于為新生骨組織提供合適的空間（圖2）。

圖2 LP支架的微觀結(jié)構(gòu)、機(jī)械性能和降解特性；a) LP支架橫截面和垂直截面的SEM視圖；b) 示意圖描繪了從低濃度到高濃度的SF溶液冷凍鑄造過程中形成的較薄層狀、中等層狀和橋接較厚層狀的結(jié)構(gòu)；c) LP支架在低倍率下的SEM（左圖）和LP支架的超薄切片（右圖）；d) LP支架在振蕩條件下在PBS或不同酶活性（10 U/mL和1 U/mL）的蛋白酶中的降解曲線；e, f) LP支架的層狀厚度（e）和層狀間距（f）的量化，顯示隨著SF濃度的增加，LP支架的層狀厚度顯著增加，但層狀間距幾乎不變；g) LP支架的壓縮模量；h) σ50指支架在50%壓縮應(yīng)變下的應(yīng)力

2. 對細(xì)胞活力及成骨誘導(dǎo)的影響

為了評估SF支架對細(xì)胞行為的影響，研究人員將人源MSCs和大鼠源MSCs接種于支架上進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果均顯示，LP支架相較于HP支架更有利于細(xì)胞附著、遷移和增殖，在長期細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)中，LP支架上的MSCs數(shù)量多于HP支架，且細(xì)胞在LP支架上分布更均勻，形態(tài)更佳（圖3）。這種良好的細(xì)胞親和性為骨組織的再生提供了充足的細(xì)胞來源。

在成骨誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，LP支架上的細(xì)胞表現(xiàn)出更高的成骨標(biāo)志物表達(dá)，如BMP2和RUNX2，以及更多的礦化沉積。這表明LP支架能夠有效誘導(dǎo)MSCs向成骨細(xì)胞分化，進(jìn)而發(fā)育成皮質(zhì)骨類器官。這一發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步表明，具有層狀結(jié)構(gòu)的SF支架可能更適合用于骨組織器官的發(fā)育與再生。

圖3 MSCs在SF基3D支架中的形態(tài)、增殖和成骨分化；a) 天然骨和LP支架的微觀到宏觀形態(tài)示意圖，顯示皮質(zhì)骨組織和LP支架在微米級別具有相似的層狀結(jié)構(gòu)，有利于細(xì)胞粘附和遷移；b) SF基3D支架內(nèi)hMSCs的長期細(xì)胞活性；c) hMSCs在SF支架內(nèi)培養(yǎng)4、10和14天后的3D共聚焦成像。綠色熒光代表FITC標(biāo)記的細(xì)胞，藍(lán)色熒光表示SF支架的自發(fā)熒光；d) SEM圖像顯示，LP支架層狀結(jié)構(gòu)上的hMSCs明顯沿層狀延伸方向伸長，而HP支架上的hMSCs隨機(jī)伸長；e, f) 在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)14天的rMSCs的免疫熒光染色（e，細(xì)胞中的BMP2標(biāo)記為綠色，細(xì)胞中的Runx2標(biāo)記為紅色；支架在大面積上也表現(xiàn)出自發(fā)的綠色熒光）和茜素紅染色（f）；g, h) 通過ELISA在14天時(shí)培養(yǎng)基上清液中RUNX2（g）和BMP2（h）濃度的定量分析；i, j) 在正常培養(yǎng)基中培養(yǎng)14天的hMSCs的ALP定量分析（i）和歸一化的OCN和Col-1 mRNA水平（j）

3. 血管生成與免疫調(diào)節(jié)作用

研究發(fā)現(xiàn)LP支架還能顯著促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的行為，這為骨缺損修復(fù)提供充足的血液供應(yīng)和營養(yǎng)物質(zhì)。此外，支架還能夠調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的表型，使其從促炎型（M1型）轉(zhuǎn)化為抗炎型（M2型），從促炎狀態(tài)轉(zhuǎn)向抗炎狀態(tài)。這種特性有助于加速新血管形成并減少炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步支持了其在骨修復(fù)中的應(yīng)用潛力（圖4）。

圖4 LP支架對hUVEC細(xì)胞行為和巨噬細(xì)胞極化的影響；a) hUVECs在LP支架上的增殖評估；b) hUVECs在支架上的形態(tài)。c) 在支架上培養(yǎng)的hUVECs中CD31表達(dá)的免疫熒光可視化；d, e) 在SF基支架（LP和HP）上培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)（d）和M1/M2極化圖（e）

4. 動物實(shí)驗(yàn)：大鼠骨缺損模型中的初步驗(yàn)證

研究人員首先在大鼠骨缺損模型中測試了這種層狀支架的效果。通過Micro-CT成像，他們觀察到在植入后1個(gè)月，支架已經(jīng)促進(jìn)了新骨組織的生長，骨缺損區(qū)域開始被新生骨組織填充。到了3個(gè)月時(shí)，骨缺損幾乎完全愈合，顯示出層狀支架在骨修復(fù)中的巨大潛力。隨后進(jìn)行馬松三色染色（圖5c）和半定量分析（圖5d、5e），更詳細(xì)地分析再生骨組織的分布和成熟度。植入1個(gè)月時(shí)，LP組MT染色呈淡藍(lán)色（來自纖維組織的膠原纖維）和紅色（細(xì)胞質(zhì)）（圖5c），表明宿主炎癥細(xì)胞和纖維細(xì)胞在這些支架內(nèi)被募集。值得注意的是，植入1個(gè)月后，在LP支架周圍觀察到一小塊礦化骨組織（深藍(lán)色，圖5c， 5f）。其中，MSC接枝的 LP12的新生骨再生跡象最多。通過免疫組化染色，研究人員發(fā)現(xiàn)層狀支架能夠顯著提高骨基質(zhì)蛋白（如OPN和OCN）的表達(dá)。這些蛋白在骨形成過程中起著關(guān)鍵作用，它們的高表達(dá)表明層狀支架能夠有效促進(jìn)骨基質(zhì)的形成和礦化，加速骨組織的成熟。

此外，支架生物降解可以為骨組織再生提供合適的位點(diǎn)，支架降解動力學(xué)與支架的幾何形狀高度相關(guān)。甲苯胺藍(lán)染色顯示，與1個(gè)月相比，LP支架和HP12支架在植入3個(gè)月后降解明顯，而HP18支架降解面積最小（圖5h， 5i），說明LP支架適當(dāng)?shù)慕到饴士梢源龠M(jìn)骨組織再生。綜上所述，具有板層結(jié)構(gòu)的LP支架可以在植入早期招募細(xì)胞滲透進(jìn)支架，從而實(shí)現(xiàn)支架降解和骨重塑。

圖5 使用圓柱形LP支架修復(fù)大鼠橈骨缺損；a) 示意圖顯示在大鼠骨缺損模型中接種hMSCs的LP支架以誘導(dǎo)成骨；b) 支架植入缺損區(qū)域后1個(gè)月和3個(gè)月的 micro-CT 圖像。虛線框顯示原始缺損區(qū)域；c) 植入1個(gè)月和3個(gè)月后支架與再生組織復(fù)合物的典型MT染色；d, e) MT染色的面積百分比（d）和強(qiáng)度密度（e）的半定量結(jié)果；f, g) 手術(shù)后1個(gè)月接種或未接種hMSCs的支架中OPN的免疫組織學(xué)特征；h, i) 甲苯胺藍(lán)染色圖像（h）和半定量結(jié)果（i）

5. 豬模型中的進(jìn)一步驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證層狀支架的效果，研究人員在豬模型中進(jìn)行了更深入的實(shí)驗(yàn)，首先，將圓柱形LP支架植入巴馬（BM）豬的LSBD，其片層垂直于長骨的z軸（長度方向，圖6）。在植入后2個(gè)月，micro-CT 成像顯示，層狀支架組的骨缺損區(qū)域已經(jīng)出現(xiàn)了明顯的骨再生跡象，而對照組的骨缺損幾乎沒有變化。到了5個(gè)月時(shí)，層狀支架組的骨缺損幾乎完全愈合，新骨組織與原有骨組織完美融合，顯示出層狀支架在大型動物模型中的有效性。為了驗(yàn)證血管生成是否與骨修復(fù)效果有關(guān)，研究人員發(fā)現(xiàn)，2個(gè)月后，未接種和MSCs接種的LP18組均出現(xiàn)了小直徑血管的再生。令人驚訝的是，術(shù)后5個(gè)月，有和沒有MSC接種的LP18組的再生血管數(shù)量和直徑都大于沒有MSC接種的HP18組。這些結(jié)果表明，與HP支架相比，LP支架可以促進(jìn)骨缺損區(qū)血管的形成。上述在BM豬模型的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與大鼠骨缺損實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，即具有有序板層結(jié)構(gòu)的LP支架能夠促進(jìn)細(xì)胞的募集和增殖，從而促進(jìn)早期血管化、OPN的表達(dá)和血管化骨組織在LSBD部位的再生。

之后，為了驗(yàn)證板層結(jié)構(gòu)植入方向?qū)窃偕Ч挠绊懀芯咳藛T制備了大尺寸長方體LP支架，沿平行于骨z軸的板層方向修復(fù)BM豬缺損骨組織（平行型植入，圖7），結(jié)果令人驚喜。短短三個(gè)月內(nèi)，即使沒有生長因子的輔助，支架也成功促進(jìn)了新血管的生成，加速了骨再生，修復(fù)了大型骨缺損。而且，通過控制層狀結(jié)構(gòu)與骨長軸平行植入，骨再生效果還能進(jìn)一步提升。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，這種支架能通過改變巨噬細(xì)胞的表型，從促炎的 M1 型轉(zhuǎn)變?yōu)榭寡椎?M2 型，為骨再生營造良好的免疫環(huán)境。同時(shí)，支架的降解速率也與骨再生過程完美匹配，在降解過程中為新生骨組織提供了合適的空間和條件。通過這些動物實(shí)驗(yàn)，絲素蛋白層狀支架在骨缺損修復(fù)中展現(xiàn)出了卓越的效果。從大鼠到豬模型，平行于骨長軸的植入方式不僅促進(jìn)了新骨組織的生長，還加速了骨組織的成熟和功能恢復(fù)。

圖6 在豬脛骨缺損中使用垂直于長骨長軸（z軸）的層狀LP支架進(jìn)行骨再生分析；a) 示意圖顯示豬LSBD模型的建立以及SF支架在缺損部位的定向和放置；b) 術(shù)后兩個(gè)月的定量 micro-CT 評估骨參數(shù)，包括骨礦物質(zhì)密度（BMD）、組織體積比（BV, BV/TV）和小梁骨屬性（Tb. Th, Tb. N, Tb. Sp）；c) 植入2個(gè)月和5個(gè)月后豬脛骨骨再生的代表性micro-CT 圖像；d) 支架-組織復(fù)合物的典型MT染色

圖7 在豬脛骨缺損中使用平行于長骨z軸的層狀LP支架進(jìn)行血管化和骨再生。a) 示意圖顯示矩形豬骨缺損模型的構(gòu)建和矩形SF支架的植入；b) 再生豬骨的代表性 micro-CT 圖像；c) 圖像顯示植入后1個(gè)月和3個(gè)月的再生骨組織。虛線框表示支架存在的位置；d) 豬骨缺損模型中OCN、CD31、CD80和CD206的MT染色和免疫組織學(xué)特征；e) 示意圖顯示LP支架在缺損骨部位誘導(dǎo)基于血管化的骨再生過程。當(dāng)LP支架植入時(shí)，血凝塊在LP支架周圍形成，并在手術(shù)期間吸引炎癥細(xì)胞識別支架。在植入中期，LP支架在體內(nèi)巨噬細(xì)胞的影響下有序降解；同時(shí)，小血管和骨痂在植入支架部位逐漸形成。在后期，LP支架在體內(nèi)降解，骨痂組織轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)構(gòu)有序的成熟骨組織

未來展望：骨修復(fù)的新曙光

這項(xiàng)研究的意義重大，它不僅提供了一種無需外源性生長因子、僅通過改變支架微觀結(jié)構(gòu)和植入方式就能實(shí)現(xiàn)骨組織修復(fù)的新方法，還為未來皮質(zhì)骨類器官的制造和骨修復(fù)策略的發(fā)展開辟了新道路。此外，該支架技術(shù)有望應(yīng)用于其他骨缺損修復(fù)領(lǐng)域，例如脊柱融合、關(guān)節(jié)置換等，為更多骨缺損患者帶來福音！想象一下，未來那些因各種原因遭受骨缺損困擾的患者，或許能借助這種絲素蛋白層狀支架，重新恢復(fù)骨骼的健康和生理功能，告別長期的病痛折磨。當(dāng)然，這只是一個(gè)開始，后續(xù)還需要更多的研究來優(yōu)化支架的性能，探索其在不同類型的骨缺損修復(fù)中的應(yīng)用潛力。但無疑，這項(xiàng)研究已經(jīng)為骨組織工程領(lǐng)域注入了一劑強(qiáng)心針，讓我們對戰(zhàn)勝骨缺損這一醫(yī)學(xué)難題充滿了更多信心。

參考資料：

https://doi.org/10.1002/adma.202414543

來源：課題組供稿