1、基毒雜質的定義

 

基因毒性雜質(Genotoxic Impurity，GTI)：是指能直接或間接損傷細胞DNA，產生致突變和致癌作用的物質。

 

潛在基因毒性雜質(Potential Genotoxic Impurity，PGI )：是指具有警示結構，但尚未經實驗證實具有遺傳毒性的雜質。

 

此處，咱們簡單延伸說下基毒雜質是如何損傷DNA，導致突變和致癌的。

 

首先基毒雜質的作用對象是DNA，即脫氧核糖核酸。它帶有合成RNA和蛋白質所必需的遺傳信息，是生物體發育和正常運作必不可少的生物大分子。

 

DNA 分子結構中，兩條多脫氧核苷酸鏈圍繞一個共同的中心軸盤繞，構成雙螺旋結構。脫氧核糖-磷酸鏈在螺旋結構的外面，堿基朝向里面。兩條多脫氧核苷酸鏈反向互補，通過堿基間的氫鍵形成的堿基配對相連，形成相當穩定的組合。如下圖：

脫氧核苷酸由堿基、脫氧核糖和磷酸構成。其中堿基有4種：腺嘌呤（A）、鳥嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）。四個堿基中有很多的親核位點，比如嘧啶環和嘌呤上的N和O等，這些位點可以與親電試劑（如烷基化試劑、酰基化試劑等）反應而產生不可逆的變化，從而引起基因突變。以鳥嘌呤為例，結構見下圖：

 

 

事實上，DNA的反應種類除了只反應某一處位點外，還會有一些比較復雜的反應類型：

 

有的堿基上不僅含有一個親核位點，如果一個致癌物有兩處親電位點，反應一處后，還會和堿基的另外一個位點反應，生成一些小環。

 

雙親電基團的另外一個基團也有可能和兩個不同的堿基鏈接，甚至可以和兩個螺旋上的不同堿基鏈接。

 

另外，DNA的反應活性除了親核性之外，主要還受空間結構的影響。

 

2、基毒雜質的來源

 

基因毒性雜質主要來源于原料藥合成過程中的起始物料、中間體、試劑和反應副產物。此外，藥物在合成、儲存或者制劑過程中也可能會降解產生基因毒性雜質。 

 

3、基毒雜質的分類

 

參考ICH M7，它將基毒雜質根據不同的控制措施分為了以下五大類。

 

結合這個分類補充說明的兩點就是：1）具有誘變性，不一定會致癌；2）具有警示結構，不一定具有誘變性。因此，通常1、2類是根據具體的實驗數據來確認，而3、4、5類則根據科學的定量構效關系（Q）SAR或Ames細菌試驗來確認。

 

4、基毒雜質的評估

 

目前基毒雜質的評估，主要采用兩個互補的(Q)SAR 預測方法。一個方法基于專家知識規則，另一個方法基于統計學。

 

如果經兩種互補的(Q)SAR方法預測均沒有警示結構，則足以得出該雜質沒有致突變性擔憂的結論，可不做進一步的檢測，歸為第5類雜質。

 

基于專家知識規則的方法：規則來源于專家系統的知識和毒理學試驗的結果，如DEREK。

 

基于統計學方法：由一組化合物的生物學和毒理學數據進行統計學分析預測，建立模型，再自動生成化學結構及所引發毒性作用的量化關系，預測待測物毒性。如Sarah Nexus。

 

5、基毒雜質的控制策略

 

基毒雜質的控制的基本策略是A-C-E（Avoid-Control-Expel），即避免基毒雜質生成、控制基毒產生和將基毒清除出產物。

 

 

1、通過改變原料、試劑及投料順序可以避免生成基毒雜質；

 

2、通過反應機理的研究（如溫度、時間、pH等）可以控制基毒雜質的生成；

 

3、通過后處理（如萃取、結晶、干燥等）可以去除已生成的基毒雜質。

 

在ICH M7中主要列舉了以下四種控制策略：

 

原料藥質量標準中控制在可接受限度以下，即終點控制。

 

起始物料或中間體標準或中控過程中控制在可接受限度以下，即原料或過程控制。

 

起始物料或中間體標準或中控過程中控制在可接受限度以上，明確雜質去向，結合加標試驗的清除率，確保在成品中殘留量小于可接受限度的30%以下。

 

充分理解工藝參數和影響雜質殘留因素，能確保在成品原料藥中的殘留在可接受限度以下，無需檢測，也不訂入任何標準。如基于理化性質（反應活性，溶解性、揮發性等）的分析。

 

6、基毒雜質的控制方法

 

雜質控制的目的是為了保障患者的安全。同時雜質的毒性是與劑量息息相關的，基毒雜質也不例外。由于生物系統存在自我修復和糾正的功能，使得我們無法直接通過試驗（如劑量從低到高，對其影響性進行線性推斷）獲得某個雜質的毒性閾值。

因此，對于基毒雜質的控制需要確定一個可接受其風險的攝入量------毒理學關注閾值（Threshold of Toxicological Concern，TTC）

 

TTC的定義是針對所有化學物質的一個暴露水平，當低于該水平時，無論是否獲得化學特異性的毒性數據，在終生服用的情況下對人體健康都不會產生明顯的危害。換句話說就是每天攝入1.5微克的基因毒性雜質，被認為對于大多數藥品來說是可以接受的風險。因為它使得人一生的致癌風險小于十萬分之一。而現實生活中，人一生得癌癥的概率是四分之一。

對于TTC，我們需要說明的是：

 

1）TTC它是一個風險管理工具，采用的是概率的方法，不能被理解為是絕對無風險的保障。 

 

2）致癌性明確的雜質需進行特殊的風險評價，TTC 法并不適用。有幾個結構基團被認定為具有非常高的基因毒性，它們即使被攝入低于TTC值的量也會面臨非常高的基因毒性風險。如黃曲霉毒素類、N-亞硝胺類、烷基偶氮化合物類等。

 

3）結構不同的單個雜質的限度應該小于1.5微克/天。有相同作用機制、結構相似的雜質，其含量總和的限度仍應該參考1.5微克/天的限量進行評估（見表2）。而多個作用機制不同的基因毒性雜質可攝入總量則可應參考表3。

 

4）在某些特定情況下，TTC值高于1.5微克/天也是可以接受的。例如：

 

藥物的短期接觸，即治療某些生命預期在5年以下的某些嚴重疾病。

 

它是一種已知物質，人類在其他方式上對它的攝入量會更高（如食品、環境中）。

 

它是一種體內代謝物，對它的評價也要以代謝物的可接受程度為基礎。

 

7、基毒雜質的限度計算

 

第一種：具有陽性致癌數據的誘變雜質。如半數致癌劑量TD50，線性外推來計算可接受攝入量（AI，acceptable intake） 

 

計算公式：

 

第二種：基于TTC控制的雜質限度計算。TTC=1.5ug/day，短期暴露可適當提高。

 

計算公式：

 

第三種：有實際閾值證據的誘變性雜質。使用不確定因子，參考ICH Q3C計算允許日暴露量 （Permit Daily Expourse，PDE）。

 

計算公式：

其中，公式中各校正因子的規定如下：

 

F1是考慮物種間差異的因子

F1=5，適用于從大鼠外推到人

F1=12，適用于從小鼠外推到人

F1=2，適用于從犬外推到人

F1=2.5，適用于從家兔外推到人

F1=3，適用于從猴外推到人

F1=10，適用于從其他動物外推到人

 

F2=10，考慮個體差異的因子

所有有機溶劑一般取因子10。

 

F3是考慮短期暴露的毒性研究的可變因子

F3=1. 研究時間至少為動物壽命一半(嚙齒動物或兔為1年，貓、狗和猴為7年）

F3=1. 涵蓋整個器官形成期的生殖研究

F3=2，為期6個月的嚙齒動物研究，或為期3.5年的非嚙齒動物研究

F3=5. 為期3個月的嚙齒動物研究，或為期2年的非嚙齒動物研究

F3=10. 持續時間更短的研究

在所有情況下，對研究時間介于上述時間點之間的研究應用較大的因子，如對為期9個月的嚙齒類動物毒性研究采用因子2。

 

F4是在諸如非遺傳毒性致癌性、神經毒性或致畸性等嚴重毒性的情況下可應用的因子。

在生殖毒性研究中采用以下因子：

F4=1，與母體毒性有關的胎兒毒性

F4=5， 無母體毒性的胎兒毒性

F4=5， 有母體毒性的致畸反應

F4=10，無母體毒性的致畸反應

 

F5是未確定無反應水平時可應用的可變因子

在只有LOEL可用時，根據毒性的嚴重程度，可以使用高達10的因子。

 

體重調整假設任何成年人的體重為 50kg(不論性別）。

相對于這類計算中常用的60kg 或70kg 標準體重，較小的體重提供了額外的安全因子。有些成年患者體重小于50kg。在確定PDE時，對這些患者應考慮對固有的安全因子進行調整。

 

最后，補充一張ICH M7中公布的有特定閾值的雜質列表。