摘要
目的：對中藥的傳統(tǒng)與現(xiàn)代鑒別技術(shù)進行綜述，以期為中藥鑒定方法的開發(fā)與中藥質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的提升提供參考與借鑒。方法：對中藥的傳統(tǒng)鑒定方法、中藥的現(xiàn)代鑒定方法、DNA條形碼鑒定技術(shù)、基于DNA條形碼的SNP分型方法、下一代測序（NGS）技術(shù)在中藥鑒定中的應(yīng)用等幾個方面進行了梳理。結(jié)果：中藥鑒定學(xué)在傳統(tǒng)鑒別技術(shù)的基礎(chǔ)上逐步形成與植物系統(tǒng)分類學(xué)、植物化學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)及現(xiàn)代儀器分析等多學(xué)科的知識和技術(shù)的大融合，為中藥真?zhèn)蔚蔫b別提供了更廣泛的選擇。結(jié)論：中藥的應(yīng)用歷史源遠(yuǎn)流長，同時中藥在漫長的歷史沿革與傳承中也存在嚴(yán)重的混偽、代用現(xiàn)象。中藥鑒定是促進中藥應(yīng)用國際化和質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)化的基礎(chǔ)，是保障人民用藥安全的重要前提。
中藥是指在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下用以防治疾病的藥物，其藥用歷史悠久，具有資源豐富、品種眾多、來源復(fù)雜、形態(tài)和組織千變?nèi)f化、化學(xué)成分或有效成分復(fù)雜的特點。在中藥的歷史沿革中，由于本草記載粗略，存在正品、混淆品、習(xí)用品、偽品、野生品、栽培品等的差異，同時由于中藥材在使用過程中存在同物異名、同名異物現(xiàn)象，導(dǎo)致中藥的混偽、代用現(xiàn)象嚴(yán)重，加之中藥成分的復(fù)雜性，使得中藥質(zhì)量控制過程中存在著難以定性定量分析、沒有統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等問題，中藥質(zhì)量不穩(wěn)定、難以控制。同時，在藥材的生產(chǎn)加工過程中，由于生產(chǎn)加工人員素質(zhì)和業(yè)務(wù)能力的參差不齊，以及市場利益驅(qū)使的影響，使得我國中藥材市場中存在不少問題，給中藥的深入研究帶來很大困難[1-2]。
中藥鑒定學(xué)是在古代本草學(xué)和現(xiàn)代生藥學(xué)的基礎(chǔ)上形成并發(fā)展起來的一門學(xué)科，是鑒定中藥的品種和質(zhì)量，研究、尋找和擴大新藥源的應(yīng)用學(xué)科，是在繼承傳統(tǒng)鑒別經(jīng)驗的基礎(chǔ)上，對近代自然科學(xué)的理論知識和鑒定方法的運用，是保障中藥用藥安全的前沿學(xué)術(shù)課題，是中藥標(biāo)準(zhǔn)化和國際化的基礎(chǔ)，具有現(xiàn)代科學(xué)和傳統(tǒng)文化的雙重內(nèi)涵[3-4]。
中醫(yī)藥的應(yīng)用歷史源遠(yuǎn)流長。在當(dāng)前我國大力加強中藥研究和加速中藥現(xiàn)代化進程的形勢下，中藥的準(zhǔn)確鑒別是確保中藥質(zhì)量合格和科研結(jié)果可靠的重要工作。中藥鑒定工作者對傳統(tǒng)鑒別技術(shù)中有價值的部分進行繼承與發(fā)揚，并在此基礎(chǔ)上不斷研究和發(fā)展實用的中藥現(xiàn)代鑒別技術(shù)，逐步形成與植物系統(tǒng)分類學(xué)、植物化學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)及現(xiàn)代儀器分析等多學(xué)科的知識和技術(shù)的大融合。21世紀(jì)初開始，現(xiàn)代生物技術(shù)、現(xiàn)代儀器分析技術(shù)和計算機技術(shù)被大量應(yīng)用于中藥的鑒定研究，生物鑒定方法也得到不斷發(fā)展與完善，這些都標(biāo)志著中藥鑒定學(xué)已經(jīng)進入了生命科學(xué)和信息科學(xué)的時代，推動了中藥鑒定學(xué)步入一個新的發(fā)展階段。
一、中藥的傳統(tǒng)鑒定方法
中藥鑒定是進行中藥相關(guān)應(yīng)用型研究中的基本工作，隨著中藥鑒定研究的技術(shù)與方法的不斷進步，傳統(tǒng)的中藥鑒定方法仍具有重要意義[5]。二十世紀(jì)八十年代至九十年代中后期，樓之岑院士和徐國鈞院士牽頭開展了對213類中藥材品種整理與質(zhì)量評價的系統(tǒng)研究，對多來源中藥進行本草考證、整理與鑒別，并形成了中藥鑒定學(xué)“四大鑒別”方法的研究體系[6-7]，主要包括基原鑒定、性狀鑒定、顯微鑒定和理化鑒定，以上方法均有其獨特優(yōu)勢和適用的鑒定對象，有時候還需要選擇其中兩種或兩種以上方法配合使用，才能準(zhǔn)確完成一種中藥材的鑒定。
基原鑒定是中藥鑒定的基礎(chǔ)，是采用系統(tǒng)分類學(xué)的方法確定中藥的來源物種，一般以植物藥為多，在碰到較完整的植物藥材時，應(yīng)用植物分類學(xué)的知識直接通過肉眼觀察或借助放大鏡、解剖顯微鏡等外部工具觀察其根、莖、葉和果實等部位的特征，以達(dá)到準(zhǔn)確鑒定的目的。傳統(tǒng)本草和現(xiàn)代著作中記載的中藥、民族藥來源是當(dāng)代中藥、民族藥的用藥依據(jù)之一，通過與植物分類學(xué)相關(guān)的著作和中藥鑒定方面的著作核對，可確定中藥來源，在有條件的情況下還可以通過核對標(biāo)本進行鑒定[5]。其是對中藥品種的古今使用情況進行考證并探討其演變歷史、對藥材原植物進行實地分類鑒定、結(jié)合現(xiàn)代臨床藥材應(yīng)用情況和藥理藥化研究進展進行中藥品種的整理工作，是中藥傳統(tǒng)鑒定研究的一個基本方法[8]。
性狀鑒別是以傳承傳統(tǒng)的鑒別經(jīng)驗為基礎(chǔ)，是古今眾多醫(yī)者在長期工作過程中對積累的經(jīng)驗的總結(jié)，傳承了“辨狀論質(zhì)”的傳統(tǒng)鑒別經(jīng)驗與方法，該方法簡單、易行，通過眼觀、手摸、鼻聞、口嘗、水試、火試等，觀察中藥的形狀、大小、顏色、質(zhì)地、表面特征、斷面情況、氣味以及水試和火燒反應(yīng)，來判斷中藥的種類和品質(zhì)[1]。水試法通常將中藥與水以浸泡、濕潤等方式處理，觀察某些中藥材遇水后或在水中產(chǎn)生的各種比較明顯或特殊的變化以鑒定其品種真?zhèn)巍?yōu)劣，是非常實用的方法，主要包括顯色反應(yīng)、旋轉(zhuǎn)現(xiàn)象、掛甲反應(yīng)、膨脹反應(yīng)、沉浮反應(yīng)、黏液反應(yīng)、乳化反應(yīng)、泡沫現(xiàn)象、熒光反應(yīng)。火試主要是對中藥材進行加熱、燃燒等方式處理，觀察藥材的各種變化，例如顏色的改變（火焰、藥材、灰燼）、煙霧的大小、爆鳴聲響及熔化、升華現(xiàn)象的改變等，利用這些現(xiàn)象進行鑒別[8]。這些方法具有簡便、快速的特點，但對多來源藥材、破碎藥材、粉末藥材和中成藥進行鑒定時就存在一定的局限性，無法客觀、準(zhǔn)確地進行鑒定[9]。
20世紀(jì)70年代到80年代顯微鑒別技術(shù)發(fā)展起來[10]，顯微鑒定是用顯微鏡觀察中藥組織結(jié)構(gòu)和粉末特征的方法，建國后中國才真正開始藥材粉末的顯微鑒別研究，這是中藥鑒定研究的重要內(nèi)容[8]。通過觀察藥材的組織切片、粉末、解離組織或表面制片及成方制劑中藥材的組織構(gòu)造、細(xì)胞形狀或內(nèi)含物等特征，鑒定藥材真?zhèn)巍⒓兌取⑵焚|(zhì)。顯微鑒別方法主要包括橫切片或縱切片觀察、粉末制片觀察、表面制片觀察、解離組織片觀察、顯微化學(xué)法觀察、由粉末藥材制成的成方制劑的觀察等，通常應(yīng)用于單憑性狀不易識別的藥材、破碎藥材、粉末藥材以及丸、散、膏、丹等中藥成方制劑的鑒別[5]。
80年代后期理化鑒別逐漸興起[10]，理化鑒定是采用物理方法或化學(xué)方法，對中藥中所含有的有效成分或特征性成分進行定性或定量分析，用以鑒定藥材的真?zhèn)魏唾|(zhì)量的優(yōu)劣。中藥中的有效成分是其發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，理化鑒別方法主要包括顯色反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、熒光法、微量升華法、分光光度法、色譜法、膨脹度測定法、旋光度測定法、折光率測定法、pH測定法、酸值和皂化值的測定法、水分測定法、灰分測定法、浸出物測定法、揮發(fā)油測定法等[5]。
中藥鑒定是促進中藥應(yīng)用國際化和質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)化的基礎(chǔ)，是保障人民用藥安全的重要前提，也是中藥在傳承幾千年的過程中一直有待解決的問題。中藥鑒定中的現(xiàn)代鑒定方法與傳統(tǒng)鑒定方法是相輔相成的，既需要借助現(xiàn)代的科學(xué)技術(shù)對傳統(tǒng)鑒定方法進行科學(xué)的計量，又要在傳統(tǒng)鑒定方法的基礎(chǔ)上不斷創(chuàng)新，開發(fā)新的鑒定策略[2]。
二、中藥的現(xiàn)代鑒定方法
早期中藥鑒定方法包括基原鑒定、性狀鑒定、顯微鑒定和理化鑒定四大鑒別法，隨著中藥材鑒定技術(shù)與方法不斷發(fā)展與革新，性狀鑒定、顯微鑒定和理化鑒定的方法也結(jié)合新的技術(shù)，形成專屬性更強、準(zhǔn)確性更高的新的鑒定方法。90年代分子鑒別技術(shù)逐漸興起，又逐漸發(fā)展和完善了生物鑒定法[8,10]。
中藥的性狀鑒定通過與現(xiàn)代數(shù)碼技術(shù)、信息技術(shù)和計算技術(shù)的結(jié)合，發(fā)展形成了中藥形態(tài)結(jié)構(gòu)計算機三維重建與實時動態(tài)顯示技術(shù)、中藥微形態(tài)鑒定技術(shù)、中藥脈序圖譜鑒別技術(shù)和仿生識別技術(shù)等[11]，通過將現(xiàn)代先進的智能識別技術(shù)應(yīng)用于中藥的性狀鑒別，發(fā)展并形成了較為客觀的中藥性狀評價方法。其中，中藥的微形態(tài)鑒定方法是借助儀器觀察中藥材表面（包括斷面）的微形態(tài)特征，即肉眼不易察覺的細(xì)微性狀特征，該方法豐富了性狀鑒定的信息，是較為簡單、實用和直觀的方法[8]。
數(shù)碼攝影技術(shù)和偏光顯微鏡、體視顯微鏡、透射顯微鏡、熒光顯微鏡、電子顯微鏡、掃描電子顯微鏡等的發(fā)展，以及顯微鑒定技術(shù)與電子技術(shù)、數(shù)碼圖像化技術(shù)的結(jié)合，使中藥材及中藥飲片的細(xì)胞、組織、內(nèi)含物等微觀結(jié)構(gòu)特征的深入研究成為可能[12]。透射顯微鏡能觀察到亞顯微和細(xì)胞器結(jié)構(gòu)，體視顯微鏡、掃描電鏡能清楚地辨別細(xì)胞表面的精微紋飾和附屬物，偏光和熒光顯微鏡能觀察顯微結(jié)構(gòu)和顯微特征的鑒別信息[8]。顯微鑒定法具有快速、簡便、準(zhǔn)確的優(yōu)點，是中藥鑒定的主要方法之一[3,10]。
隨著中藥理化鑒定技術(shù)的發(fā)展，色譜、光譜鑒定方法成為中藥定性定量分析的主要物理化學(xué)方法。近些年來，中藥鑒定常用光譜法有近紅外光譜法（Near Infrared Spectrometry，NIR）、中紅外光譜法（Mid-infrared Spectroscopy，MIR）、質(zhì)譜法（Mass Spectrometry，MS）與X射線衍射法（X-rayDiffraction，XRD）、紫外－可見光譜法、拉曼光譜鑒定法等。其中紅外光譜法是根據(jù)待鑒定藥材中所含化學(xué)成分在紅外光區(qū)產(chǎn)生的吸收與疊加光譜特征同正品藥材進行對比，以判定藥材的真?zhèn)危蛔贤?可見光譜法鑒定中藥材的原理與紅外光譜法類似，也是通過待鑒定藥材所含化學(xué)成分的吸收疊加形成復(fù)合譜，根據(jù)紫外疊加光譜的特異性和穩(wěn)定性，以及相同藥材間紫外疊加光譜存在的規(guī)律性而作出正偽品的判別。色譜法在中藥鑒定中得到廣泛應(yīng)用，根據(jù)流動相與固定相的分子聚集狀態(tài)以及操作形式的差異，色譜法又分為紙色譜法、柱色譜法、薄層色譜法（Thin Layer Chromatography，TLC）、氣相色譜法（Gas Chromatography，GC）、高效液相色譜法（High Performance LiquidChromatography，HPLC）等。薄層色譜法（TLC）最早廣泛應(yīng)用于中藥材的鑒定中，高效液相色譜法（HPLC）是目前中藥材鑒定中主要采用的方法[13]。此外，色譜與光譜聯(lián)用技術(shù)也被廣泛應(yīng)用于中藥材的鑒定中，該方法是將具高效分離性能的色譜技術(shù)和能夠獲取豐富的化學(xué)成分結(jié)構(gòu)信息的光譜技術(shù)相結(jié)合而形成的新的鑒別技術(shù)，包括高效液相色譜-質(zhì)譜（High Performance Liquid ChromatographyMass Spectrometry，HPLC-MS）技術(shù)、氣相色譜-質(zhì)譜（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）技術(shù)、紅外光譜-質(zhì)譜（Infrared SpectraMass Spectrometry，IR-MS）技術(shù)、質(zhì)譜-質(zhì)譜（Mass Spectrometry-Mass Spectrometry，MSMS）技術(shù)、氣相色譜-傅里葉變換紅外光譜（Gas Chromatography-Fourier Translation InfraredSpectroscopy，GC-FTIR）技術(shù)、高效毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜（High Performance Capillary ElectrophoresisMass Spectrometry，HPCE-MS）技術(shù)，以上這些技術(shù)在中藥品種鑒定與質(zhì)量評價方面產(chǎn)生了重大的作用，其中應(yīng)用最廣泛的是液質(zhì)（HPLC-MS）聯(lián)用技術(shù)[14-15]。
DNA分子遺傳標(biāo)記技術(shù)是通過比較物種間DNA分子的遺傳多樣性差異來進行物種鑒定的分子生物學(xué)技術(shù)，該技術(shù)主要包括限制性片斷長度多態(tài)性分析技術(shù)、多聚酶鏈反應(yīng)測序技術(shù)、隨機擴增多態(tài)性DNA（Random Amplification PolymorphicDNA，RAPD）技術(shù)、DNA序列標(biāo)記技術(shù)、生物芯片技術(shù)、DNA條形碼鑒定技術(shù)等[13,16]，DNA分子作為生物體遺傳信息的直接載體，具有不受外界因素和生物體發(fā)育階段及器官組織差異的影響的特點，每一生物體個體的任一體細(xì)胞中均含有相同的遺傳信息，因此用DNA分子特征作為遺傳標(biāo)記鑒別物種更為準(zhǔn)確可靠[17]。
隨著生物檢定技術(shù)的發(fā)展，細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)、免疫層析技術(shù)、適配體層析技術(shù)、蛋白質(zhì)標(biāo)記技術(shù)、生物效應(yīng)鑒定技術(shù)等也被應(yīng)用于中藥鑒定中，增加了中藥材的鑒定方向和中藥材正偽與質(zhì)量評價的準(zhǔn)確度[15,17]。
三、DNA條形碼鑒定技術(shù)
DNA條形碼（DNA Barcoding）技術(shù)是指選用一段標(biāo)準(zhǔn)的短DNA片段自動化地對物種進行快速、準(zhǔn)確地鑒定與識別的技術(shù)[18]。Paul Hebert首次提出DNA條形碼的概念，并將該技術(shù)引進到生物物種的鑒定中[19]。DNA條形碼技術(shù)在近些年來被廣泛應(yīng)用于生物物種分類與鑒定中，已發(fā)展成為物種鑒定相關(guān)研究方面的熱點，具有廣闊的應(yīng)用前景[20]。中藥鑒定是研究中藥品種、質(zhì)量，制定中藥標(biāo)準(zhǔn)，尋找和擴大藥源的前提和基礎(chǔ)，傳統(tǒng)的中藥鑒定主要是根據(jù)藥材的形態(tài)特征進行性狀鑒定，要求鑒定人具有足夠豐富的分類學(xué)知識和鑒別經(jīng)驗，且中藥大多為植物的某個部位，有時鑒別特征不明顯或不存在，容易造成混淆。DNA條形碼技術(shù)在中藥鑒定中的應(yīng)用與發(fā)展為中藥基原的準(zhǔn)確鑒定提供了技術(shù)支撐，彌補和克服了傳統(tǒng)中藥鑒定方法中的一些缺陷和難題[20]。
用于物種鑒定的理想的DNA條形碼序列，其種內(nèi)遺傳距離應(yīng)該明顯小于種間遺傳距離，且存在明顯的種間差異，形成間隔區(qū)，可用來區(qū)分不同物種及判斷種內(nèi)不同個體之間的變異程度[20]。利用標(biāo)準(zhǔn)的、有足夠變異的、易擴增且相對較短的DNA片段對中藥材物種進行DNA條形碼鑒定，具有鑒定結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性良好、方法通用性強等優(yōu)點。DNA條形碼技術(shù)已經(jīng)在中藥材的物種鑒定中得到廣泛應(yīng)用，同時由國家藥典委員會編纂的《中華人民共和國藥典》2020年版四部中收載了9107中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導(dǎo)原則[21]。在近年來的中藥物種鑒定中，DNA條形碼技術(shù)逐步成為了研究的重點，在中藥材鑒定、藥品流通、監(jiān)督等諸多方面都取得了很好的應(yīng)用成果。
已有研究證明，快速發(fā)展的DNA條形碼技術(shù)是區(qū)分中藥材及其相近品種的有力工具[19]。通常中藥材由于保存不當(dāng)、時間過長、加工炮制等原因，會導(dǎo)致長DNA片段（＞200bp）的提取和擴增成功率非常低[22]。Chen SL等[23]對超過6600份植物樣本進行了ITS2（Internal Transcribed Spacer 2）序列鑒別能力的測試，這些植物樣本在植物分類學(xué)中分布廣泛，結(jié)果顯示ITS2在種的水平上的鑒別成功率達(dá)92.7%。ITS2區(qū)域具有可用于設(shè)計通用引物的保守區(qū)域，易于擴增，具有足夠的變異用以區(qū)分親緣物種。基于以上特征，ITS2區(qū)域可作為中藥材鑒定的潛在標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼序列。
四、基于DNA條形碼的單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）分型方法
美國Utah大學(xué)Wittwer實驗室在2003年首次提出了高分辨率熔解（High Resolution Melting，HRM）曲線技術(shù)，這項技術(shù)是基于新型飽和熒光染料LCGreen的發(fā)明而進行的基因突變檢測[24-25]。其優(yōu)點主要有靈敏性高、特異性強、自動化程度高、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）污染少、精確定量和無需使用特異性探針等，在突變掃描、基因型分析和甲基化分析等研究中應(yīng)用廣泛[26]。HRM分析技術(shù)因其高度的敏感性和特異性，在序列差異掃描、單核苷酸多態(tài)性、插入/缺失、微衛(wèi)星序列/簡單重復(fù)序列（Simple SequenceRepeats，SSR）、甲基化檢測及定量分析中均具有顯著的優(yōu)勢[24]。同時，該技術(shù)融合了PCR反應(yīng)靈敏性高和光譜檢測技術(shù)精確定量的優(yōu)點，可用于中藥材的物種鑒定，具有操作簡便、不受藥材形態(tài)限制、無需特異性探針、引物通用性強等優(yōu)點，在人參和西洋參、金銀花和山銀花以及鹿茸等的真?zhèn)慰焖勹b別中均得到成功應(yīng)用[27-29]。
競爭性等位基因特異性PCR（KompetitiveAllele Specific PCR，KASP）技術(shù)可在廣泛的基因組DNA樣品中對SNPs和特定位點上的插入和缺失進行精準(zhǔn)的雙等位基因判斷，是基于引物末端堿基的特異匹配來對SNP分型以及插入和缺失進行檢測。KASP方法利用通用熒光探針，就可以通過簡單的touch-down PCR的方法實現(xiàn)SNP分型。作為一項靈活、經(jīng)濟、準(zhǔn)確的SNP檢測方法，KASP技術(shù)結(jié)合酶標(biāo)儀使用就可以完成SNP分型的鑒定。KASP分型技術(shù)目前在農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源研究和疾病篩選中應(yīng)用得比較廣泛，Alexanda M. Allen等[30]首次通過KASP基因分型技術(shù)區(qū)分兩個品種小麥的基因型，并生成連鎖圖。KASP技術(shù)還被應(yīng)用于玉米的種質(zhì)資源提高和SNP分型研究[31]。
多重連接依賴探針擴增（Multiplex LigationDependent Probe Amplification，MLPA）技術(shù)最早由荷蘭學(xué)者Dr. Schouten JP于2002年提出，是近幾年發(fā)展起來的一種針對待檢DNA序列進行定量和半定量分析的新技術(shù)。MLPA可以快速地同時鑒定幾十個基因的缺失和插入，可用于血液、腫瘤樣本的DNA和mRNA的表達(dá)譜分析。而且MLPA方法可以用于甲基化分析。該技術(shù)具有高效性和特異性，可在同一反應(yīng)管內(nèi)檢測多達(dá)50個核苷酸序列的拷貝數(shù)變化。目前該方法在一些疾病的篩查方面得到應(yīng)用，例如微小缺失綜合征、亞端粒異常篩查、脊髓性肌肉萎縮癥診斷、腫瘤診斷等方面，具有可多重檢測、需要樣本量少、使用的儀器少、高通量、穩(wěn)定性好、易于定量、成本較低的特點[32-33]。
實時熒光定量PCR（Quantitative Real-timePCR，qPCR）技術(shù)是一種在DNA擴增反應(yīng)過程中，以熒光化學(xué)物質(zhì)作為內(nèi)參或者外參進行標(biāo)記，對待測樣品中特定的DNA序列進行定量分析的方法，是在PCR擴增過程中，通過熒光信號標(biāo)記，對PCR擴增反應(yīng)進程進行實時檢測的方法。在PCR擴增的指數(shù)時期，模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)之間存在一定的線性關(guān)系，因此可作為定量的依據(jù)。目前主要的qPCR檢測方法有染料法和TaqMan探針法。qPCR反應(yīng)過程中，熒光信號的積累與PCR擴增產(chǎn)物的形成同步發(fā)生，在特定光信號的激發(fā)下產(chǎn)生熒光信號并被熒光監(jiān)測系統(tǒng)捕捉，從而達(dá)到實時檢測的目的。在采用定量PCR方法進行核酸分子的檢測時（例如GMO檢測、食源性病原微生物的檢測、法醫(yī)學(xué)檢測等），主要依賴于基于標(biāo)準(zhǔn)品檢測繪制而成的標(biāo)準(zhǔn)曲線。定量檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性依賴于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的準(zhǔn)確檢測與準(zhǔn)確定標(biāo)[34]。
數(shù)字PCR（Digital PCR，dPCR）是一種對PCR反應(yīng)體系進行絕對稀釋，隨后在有限個不同的獨立反應(yīng)空間內(nèi)進行PCR擴增反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后可以根據(jù)泊松分布原理以及陽性微滴的數(shù)量與比例計算得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度的技術(shù)。數(shù)字PCR技術(shù)是一種靈敏度高、定量精確、檢測范圍寬、特異性好、費用適中的分子定量檢測手段，可以對靶DNA或RNA分子的變異情況進行精確的定量分析，可以進行病原體的檢測與監(jiān)測。微滴式數(shù)字PCR具有絕對定量的優(yōu)勢，且可以排除雜蛋白、RNA分子、鹽成分等對結(jié)果的干擾[34]。數(shù)字PCR通過對PCR擴增體系的微滴化處理，使得稀有的待檢測目標(biāo)片段從高濃度的非目的檢測DNA中分離出來，從而提高了檢測的靈敏度及精確性[35]。
五、下一代測序（NGS）技術(shù)在中藥鑒定中的應(yīng)用
20世紀(jì)90年代，下一代測序技術(shù)（NextGeneration Sequencing，NGS）開始登上歷史舞臺，454測序儀上市標(biāo)志著正式進入高通量測序時代，之后Illumina公司和ABI公司相繼推出Solexa和SoLid測序技術(shù)[36]。然而，讀長相對較短仍是NGS進一步應(yīng)用的主要瓶頸[37]，較短的測序讀長為組裝基因組帶來巨大困難，尤其是高GC含量的基因組的組裝[38]。為了彌補上述的高通量測序技術(shù)的缺陷，更好地發(fā)掘DNA序列信息，研究人員研發(fā)出單分子測序技術(shù)（Singlemolecule Sequencing），主要包括Pacific Biosciences（PacBio）公司的單分子實時（Single-molecule Realtime，SMRT）測序技術(shù)、Oxford Nanopore公司的單分子納米孔測序技術(shù)（The Single-molecule Nanopore DNA Sequencing）和Helicos公司的真正單分子測序技術(shù)（True Singlemolecule Sequencing，tSMSTM）等[39]。
進入21世紀(jì)，自第一個植物基因組擬南芥被完整破解[40]以來，有近300種植物的基因組被陸續(xù)破解，并在此基礎(chǔ)上建立了相應(yīng)的植物基因組數(shù)據(jù)庫，中藥材植物是其中重要的組成部分。中藥材品種數(shù)量眾多，一項市場調(diào)查發(fā)現(xiàn)，123種常用的中藥材都有不同程度的摻假或混用的情況[41]。傳統(tǒng)的DNA條形碼技術(shù)雖然具有很好的物種區(qū)分能力，但是一般是針對單一的物種進行鑒定，礙于桑格測序的技術(shù)局限性，其對多藥味的中成藥的鑒別存在困難。NGS測序則可以解決多藥味處方的鑒別的問題，目前已有許多關(guān)于NGS技術(shù)應(yīng)用于中藥材產(chǎn)品的報道。
5.1 用于中藥產(chǎn)品的質(zhì)量控制
Peng Zhang等[42]嘗試用Pacific Biosciences（PacBio）公司的單分子實時（Single-moleculeRealtime，SMRT）測序技術(shù)對生脈散中各個藥味進行檢測，不同于傳統(tǒng)的NGS測序，其開發(fā)了一種Full-lebgth Muiti-barcoding的策略，直接對ITS2和PsbA-trnH的片段進行了測序，并選擇三味蒺藜散用于驗證方法的可行性。最終通過不同通用DNA引物的組合可以實現(xiàn)對生脈散與三味蒺藜散中所有藥味的鑒定，同時可以鑒定出外源性的物種，充分證明了此種方法用于中成藥質(zhì)量控制的可行性。
由于龍膽瀉肝丸中川木通的混用會引起馬兜鈴腎病，因此其質(zhì)量檢測要求比較嚴(yán)格，通過鳥槍法宏基因組測序[43-44]技術(shù)使用Illumina HiSeq 2500平臺對龍膽瀉肝丸[45]中的木通進行驗證，從實驗室制作的2個參考樣本（RF01和RF02）中獲得了ITS2、PsbA-trnH和MatK三個序列的共計129個有用的Contigs，實現(xiàn)了對木通及龍膽瀉肝丸中其余藥味樣本的檢測。將該方法應(yīng)用于市場收集樣本的檢測，發(fā)現(xiàn)市場樣品多存在產(chǎn)品投料缺失、偽品混用、川木通代替木通投料等情況，證明了該方法用于中藥材尤其中成藥質(zhì)量控制方面具有可行性。
Cheng等[46]基于高通量測序方法開發(fā)了一種新的用于識別中藥中生物成分的M-TCM方法，對六味地黃丸的生物成分進行分析。分析過程中選擇了3批不同制造商的六味地黃丸的藥材及自己實驗室制備的參考樣本，最終實現(xiàn)了對六味地黃丸中不同藥味與外源性生物的檢測，并通過該方法進一步驗證了有些廠家以加工過的原材料進行投料生產(chǎn)的猜測。
目前對于天南星的化學(xué)檢測方法較少，且天南星根莖具有毒性，Li等[47]通過高通量測序與實時PCR技術(shù)檢測在傳統(tǒng)如意金黃散處方中是否存在摻偽的情況，并通過是否能鑒別如意金黃散中有毒的天南星及其混偽品虎掌來確定此方法的可行性。結(jié)果顯示，市場收集的如意金黃散樣品中未檢測到天南星與厚樸，卻檢測到了虎掌和當(dāng)歸，實時PCR方法與NGS測序的檢測結(jié)果一致，進一步驗證了結(jié)果的準(zhǔn)確性。
Xin等[44]利用PACBIO RSII SMRT平臺對3份市場來源和2份實驗室自制的九味羌活丸樣品進行測序，通過對ITS2和PsbA-trnH兩種DNA條形碼的測序結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)實驗室自制的樣品中所有的藥味均被檢出，而市場購買的樣品中黃芩、蒼術(shù)、白芷、川芎等藥味未被檢測到，同時朝鮮蒼術(shù)、白術(shù)等非處方藥味和外源性的物種例如杜鵑屬、牽牛屬等卻有檢出。
Williams A等[48]利用PacBio平臺結(jié)合PCRDGGE（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis）的方法檢測當(dāng)歸補血方中處方藥味的投料是否準(zhǔn)確，并通過高效液相色譜[49]的方法檢測當(dāng)歸和黃芪中的質(zhì)量標(biāo)志物，確定其劑量關(guān)系。
5.2 用于SNP位點的檢測
針對松果菊屬中松果菊、狹葉松果菊、淡紫松果菊的種內(nèi)區(qū)分難度大及全緣葉銀膠菊存在摻假的問題，張等人[50]通過Illumina MiSeq平臺對9種常見松果菊屬物種的全葉綠體基因組進行測序與組裝。結(jié)果顯示，ITS2和PsbA-trnH引物對比MatK和RbcL引物對的分辨率更高，同時組裝得到的葉綠體全基因組中SNP位點的檢測更加便捷，且相較于通用的DNA條形碼序列更長，蘊含更多的遺傳信息。
5.3 用于貴重藥材或瀕危藥材的檢測
Arulandhu等[51]開發(fā)了一種多點DNA條形碼技術(shù)，通過Illumina MiSeq平臺對29種動物和17種瀕危植物的DNA樣本進行檢測，并對包括提取、測序、生物信息學(xué)分析與數(shù)據(jù)比對的整個全流程的可行性進行評估，結(jié)果顯示，由于Illumina測序系統(tǒng)準(zhǔn)確率較高，且一次運行可檢測多個樣本，能夠?qū)崿F(xiàn)對瀕危物種的檢測。通過Illumina MiSeq平臺驗證了NGS技術(shù)應(yīng)用于監(jiān)管與執(zhí)法方面的可行性，其具有較好的應(yīng)用前景。
六、展望
中藥鑒定是保障中藥用藥安全的前沿學(xué)術(shù)課題，是中藥標(biāo)準(zhǔn)化和國際化的基礎(chǔ)，具有現(xiàn)代科學(xué)和傳統(tǒng)文化的雙重內(nèi)涵。在當(dāng)前我國大力加強中藥研究和加速中藥現(xiàn)代化進程的形勢下，中藥的準(zhǔn)確鑒別是確保中藥質(zhì)量合格和科研結(jié)果可靠的重要工作。中藥鑒定學(xué)在傳統(tǒng)鑒別技術(shù)的基礎(chǔ)上逐步形成與植物系統(tǒng)分類學(xué)、植物化學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)及現(xiàn)代儀器分析等多學(xué)科的知識和技術(shù)的大融合。中藥是一個非常復(fù)雜的體系，從上世紀(jì)開始的顯微鑒定，到不斷發(fā)展的化學(xué)方法，都為中藥的質(zhì)量控制作出了巨大的貢獻(xiàn)。隨著近年來中藥鑒定技術(shù)的發(fā)展，DNA條形碼技術(shù)在中藥材的物種鑒定中得到廣泛應(yīng)用，通過建立中藥材標(biāo)準(zhǔn)序列的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，以及檢測標(biāo)記的篩選、獲得和檢測，可以逐步實現(xiàn)中藥材物種鑒定的標(biāo)準(zhǔn)化。NGS具有高通量和低成本的優(yōu)勢，可有效實現(xiàn)對草藥產(chǎn)品的分子生物學(xué)鑒定，目前有越來越多應(yīng)用NGS技術(shù)進行中藥質(zhì)量控制或檢測的探索研究，旨在探索建立中藥質(zhì)量新的評價方法。
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