在藥物分析工作中，常常會遇到極性較強(qiáng)的化合物，使用液相色譜法或液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對這些化合物進(jìn)行分析時(shí)，會遇到很多困難。
如果采用傳統(tǒng)的反相色譜柱，有些極性化合物常常較早時(shí)間就被流動(dòng)相洗脫，甚至在死時(shí)間流出，不能與雜質(zhì)分離；與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用，依賴于質(zhì)譜的定性技術(shù)，可以對這些物質(zhì)進(jìn)行定性，但流動(dòng)相中高比例的水相會抑制此類物質(zhì)在電噴霧離子源中的的電離，造成靈敏度下降，影響準(zhǔn)確定量。在一些分析中，如果目標(biāo)化合物較早被流動(dòng)相洗脫，柱效也難以達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求。
有些極性化合物含有堿性基團(tuán)，會與反相色譜柱中裝填的硅膠顆粒產(chǎn)生次級保留作用，在色譜圖上表現(xiàn)為拖尾峰，影響準(zhǔn)確定量；有些化合物甚至在色譜圖上不出峰。
為應(yīng)對這些問題，本文提出幾種液相色譜方法，以期對大家的工作有所幫助，起到拋磚引玉的作用。
1.采用改性C18色譜柱分析極性較強(qiáng)的化合物
改性的C18色譜柱或保留硅膠表面活性的-OH基團(tuán)，或接枝極性基團(tuán)如氨基甲酸酯等，這些基團(tuán)使得硅膠顆粒表面形成了“富水層(Rich Water Layer)”，對極性化合物產(chǎn)生保留作用，目標(biāo)化合物與干擾組分之間能夠得到有效的分離，同時(shí)，對于改善目標(biāo)化合物峰形，也有一定的幫助。
以天麻素(β-Gastrodin，4-羥甲基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷)為例，其結(jié)構(gòu)如圖1所示，ACD/LogP為-1.85，具有較強(qiáng)的極性。
圖1天麻素結(jié)構(gòu)圖
分析中成藥中天麻素含量，為增強(qiáng)其在C18色譜柱上的保留，多以低有機(jī)相含量的乙腈水溶液作為流動(dòng)相，如乙腈-水(1:100)，流動(dòng)相流速1 mL/min，等度
洗脫，使用紫外檢測器，檢測波長為220 nm，色譜圖如圖2所示。
圖2 C18色譜柱分析天麻素色譜圖
使用傳統(tǒng)C18色譜柱分析天麻素時(shí)，色譜峰寬約為1 min，天麻素軸向擴(kuò)散較為嚴(yán)重，如果以改性C18（T3）色譜柱分析天麻素，采用同樣的流動(dòng)相及流速。色譜峰寬約為0.2 min，如圖3所示，峰形更為尖銳，對稱，對于準(zhǔn)確定量和提高柱效有很大幫助。
在日常工作中，可以先大致了解物質(zhì)物化性質(zhì)，如查詢logP以了解物質(zhì)極性。使用常規(guī)C18色譜柱不能達(dá)到分析需求時(shí)，嘗試更換改性C18色譜柱。
圖3 T3色譜柱分析天麻素色譜圖
2.使用親水相互作用色譜柱
親水相互作用色譜法(HILIC)是對反相色譜法的有利補(bǔ)充，對于極性化合物，既提供了與正相色譜法相同的出峰順序和選擇性，又避免了使用正己烷等有機(jī)流動(dòng)相。同時(shí)親水相互作用色譜法中高比例的乙腈流動(dòng)相非常有利于待測物質(zhì)在電噴霧離子源中的電離，因此親水相互作用色譜法和串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用，非常適合極性化合物的分析。
以核苷和堿基為例介紹親水相互作用色譜柱的使用方法。核苷和堿基分子中含多個(gè)N，O原子，分子結(jié)構(gòu)不對稱，分子有較大的偶極矩，極性較強(qiáng)，難以溶解于普通有機(jī)溶劑，在普通C18色譜柱上幾乎沒有保留，定性定量分析存在較大困難。
以金水寶膠囊中核苷及堿基分析為例，如果使用傳統(tǒng)C18色譜柱，為了增強(qiáng)各物質(zhì)保留，需要維持流動(dòng)相中高比例水相相當(dāng)長的時(shí)間，色譜分析時(shí)間長，同時(shí)，流動(dòng)相使用純水，會使得C18碳鏈卷曲，降低色譜柱柱效。
使用C18反相色譜柱，柱溫為25°C。以甲醇-0.02mol/L磷酸二氫鉀水溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速為1 mL/min，檢測器為紫外檢測器，檢測波長260 nm，色譜圖如圖4所示，5種化合物全部洗脫時(shí)間約為30 min。
圖4使用C18色譜柱分析5種化合物
考慮到此類化合物多含有堿性基團(tuán)，可采用具有兩性基團(tuán)的親水相互作用色譜柱進(jìn)行分離，如ZIC-cHILIC色譜柱，其功能基團(tuán)為磷酸膽堿，與待分析化合物之間可能存在親水相互作用，電荷相互作用等，可以快速有效分離核苷及堿基等堿性物質(zhì)。
使用ZIC-cHILIC色譜柱，柱溫40°C，以乙腈-100 mmol/L甲酸銨水溶液為流動(dòng)相(90：10)，流速0.4 mL/min，等度洗脫，檢測器為紫外檢測器，檢測波長為263 nm。色譜圖如圖5所示，15 min內(nèi)即可完成5種化合物的分析分離。
圖5使用ZIC-cHILIC色譜柱分析5種化合物
使用C18色譜柱分析上述堿性化合物，具有非常好的分離度，但用時(shí)較長，如果使用ZIC-cHILIC色譜柱，柱效低于C18色譜柱，但是分析速率大大提高，適用于快速分離分析。
對于胺類化合物，也可以采用氨基色譜柱進(jìn)行分析，氨基色譜柱同樣為親水相互作用色譜柱。
3.使用耐堿的C18色譜柱
耐堿的C18色譜柱可以使用較高pH的流動(dòng)相，達(dá)到抑制堿性物質(zhì)電離的目的，為分離多個(gè)堿性化合物混合物的分離提供了非常好的解決方案。
抗病毒藥物有三環(huán)胺類和核苷類等，均屬于堿性化合物。無論是三環(huán)胺類還是核苷類，幾乎都含有N原子和不對稱結(jié)構(gòu)，因此具有較強(qiáng)的極性。
使用液相色譜方法或液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法分析三環(huán)胺類抗病毒藥物，如金剛烷胺，金剛乙胺，美金剛等，可以采用C18色譜柱，也可以采用親水相互作用色譜柱。分析核苷類抗病毒藥物，如阿昔洛韋，奧司他韋等一般采用親水相互作用色譜柱，如氨基柱。分析美金剛和金剛乙胺兩種化合物的混合物時(shí)，無論采用C18色譜柱還是采用氨基柱，兩者都不能得到有效分離。
金剛乙胺和美金剛是一對同分異構(gòu)體，結(jié)構(gòu)式分別如圖6，圖7所示，
圖6金剛乙胺分子結(jié)構(gòu)圖
圖7美金剛分子結(jié)構(gòu)圖
使用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對上述金剛乙胺和美金剛進(jìn)行檢測時(shí)，監(jiān)測的離子對分別為180>163，180>121和180>163，180>107。如果采用親水相互作用色譜柱如氨基色譜柱進(jìn)行分析，流動(dòng)相為乙腈-5mmol/L乙酸銨和0.2%甲酸水溶液，兩者同時(shí)出峰，180>163離子對色譜峰相互重疊，為定性帶來諸多不便，色譜圖如圖8所示。如果使用普通C18色譜柱，以甲醇-0.1%甲酸為流動(dòng)相，兩者亦同時(shí)出峰。
圖8使用氨基柱分析金剛乙胺和美金剛混合物總離子流色譜圖
根據(jù)二者結(jié)構(gòu)的細(xì)微差別，如果能充分抑制-NH2的電離，C18色譜柱應(yīng)能提供一定選擇性，實(shí)現(xiàn)二者的分離，但是一般C18色譜不能使用pH過高的流動(dòng)相，否則會造成硅膠顆粒溶解。這種情況下可以選擇可以耐受高pH的C18色譜柱，如BEH C18，HPH C18或EVO C18。使用BEH C18色譜柱，以甲醇-0.1%氨水溶液(pH=10)為流動(dòng)相，電噴霧離子源，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析金剛乙胺和美金剛，色譜圖如圖9所示，可見，美金剛和金剛乙胺得到有效分離。
圖9使用BEH C18分析金剛乙胺和美金剛混合物總離子流色譜圖
在藥物分析工作中，對于遇到的極性化合物，如果采用常規(guī)C18色譜柱分析難以滿足需求，可以根據(jù)化合物極性，酸堿性等性質(zhì)，轉(zhuǎn)換思路，選擇改性C18色譜柱或親水相互作用色譜柱進(jìn)行分析，驗(yàn)證是否滿足需求。
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