摘要 目的：討論環境分離菌在藥品微生物檢驗中的應用。方法：通過對各國藥典、法規、指導原則、行業標準和行業指南等文件的梳理和分析，列出了環境分離菌在藥品微生物檢驗中的應用建議和要求，并結合實例，進一步介紹了環境分離菌的應用范圍。結果：各國藥典和行業指南均要求或建議在消毒劑效能驗證、抑菌效力檢查、培養基方法適用性（培養基促生長試驗）、檢驗方法的適用性、快速微生物檢驗方法和微生物檢驗替代方法驗證等檢驗項目中增加使用環境分離菌（包括生產檢驗過程中人員、環境以及樣品中分離菌）。結論：與標準菌株相比，環境分離菌更能夠反映樣品或環境實際存在微生物的情況，因此，在藥品微生物檢驗中應用環境分離菌能夠使檢驗結果對產品質量或環境做出更客觀和科學的評價。可根據檢驗項目、藥品的生產工藝和產品本身的特點，在風險評估的基礎上選擇適當的環境分離菌應用于檢驗過程中。
藥品微生物的檢驗結果受多種因素影響，因此，在藥品微生物檢驗中，為保證檢驗結果的可靠性，必須使用經驗證的檢測方法并嚴格按照藥品微生物實驗室質量管理指導原則要求進行檢驗[1]。一方面，在對檢測方法進行驗證或確認時，需要使用菌株來進行相應的判斷。例如，藥品的無菌檢查、微生物限度檢查、原輔料的生物負載檢測等試驗過程的方法適用性、培養基適用性試驗均需要使用菌株。具體步驟大致為：制備菌液后接種至供試液或培養基，根據生長情況來對方法進行確認，一些定量方法要求回收率達到50%~200%，一些定性方法要求判斷生長情況，一些培養基適用性中需要判斷微生物在培養基上的菌落大小、形態特征、指示劑反應等情況[1]。另外一方面，部分檢驗方法的目的是測定高負載微生物下降的水平，評價對微生物的抑制或殺滅作用，例如抑菌效力檢查、消毒劑消毒效能驗證等，這些檢驗項目亦需要使用菌株[1-2]。
包括《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）在內的各國藥典中，一般都規定使用標準菌種進行上述試驗[1-4]。雖然這些標準菌株的應用可以使各個實驗室的結果在一定程度上具有可比性并且便于在實驗室之間進行方法轉移確認，但是又存在另一問題，就是標準菌株無法代表環境和樣品中實際污染的微生物。因此，各國藥典指導原則和行業指南中均提出在進行藥品微生物檢驗時應增加環境分離菌的使用，從而使檢驗方法的針對性更強。
從本質上來講，檢驗的目的是希望能夠檢出樣品或環境中可能存在的微生物，盡可能反映樣品或環境污染微生物的真實情況，從而為產品質量或環境的評估做出客觀科學的評價。“未檢出”中的假陰性結果可能會導致實際存在污染微生物甚至超標的產品放行到市場上威脅人們的健康，也會導致不良的生產或檢驗環境未被發現，從而影響產品的質量控制。因此，環境分離菌在藥品微生物檢驗中的應用會在一定程度上避免假陰性結果的出現，使檢驗結果更具針對性，更能反映真實情況。本文就環境分離菌在不同檢驗項目、檢驗過程中不同環節中的應用進行討論和分析，并給出環境分離菌選擇和使用的建議，希望能夠引起相關從業者對藥品研發、質量控制和監管的思考，在日常工作中酌情考慮環境分離菌的應用，進一步保障藥品微生物的檢驗方法更具針對性，使檢驗結果準確、可靠。
一、消毒劑效能驗證
消毒劑廣泛應用于藥品生產和檢驗環境，其主要目的是作用于環境，降低環境的生物負載量。因其主要作用于環境中的微生物，各國藥典、法規和指南均要求使用環境分離菌來進行消毒劑效果的確認，并且都要求根據消毒劑類型選擇合適的微生物進行考察[5]。
美國藥典第43版的《1072消毒劑和防腐劑》[2]章節中明確：因為各種菌對不同消毒劑的耐受性都有實際差異，因此，在消毒劑管理程序中，應定期使用懸液法，將環境監控中最常見的分離微生物用于確認其敏感性。為了證明消毒劑對制藥環境的效能，應進行如下試驗：（1）使用懸液法（篩查不同濃度消毒劑在不同的接觸時間條件下對于標準菌株和典型環境分離菌的消毒效能）；（2）載體法（將消毒劑置于載體表面作用于一定濃度標準菌株或環境分離菌一定的時間，測定微生物的lg下降值）；（3）在新的消毒劑使用前后，采用統計學的方法對比分離微生物的數量以及種類出現頻率的變化。
日本藥典第17版《消毒劑和除菌方法》[4]章節包括了消毒劑效果驗證，其中載體試驗的試驗菌的選擇要求為：為了評估消毒劑效果，除了選擇所列出的標準菌株，應選擇1~2株常見的環境監控分離菌。
美國食品藥品管理局 （FDA）在2004年發布的《行業指南-使用無菌生產工藝生產的無菌藥品的現行生產質量管理規范（cGMP）》[6]（以下簡稱FDA2004年無菌生產工藝指南）在環境的消毒程序部分也明確要求應重視消毒劑對環境菌的作用，即日常使用的消毒劑應當對從廠房分離的常見微生物有效。必要時，可以調查評估從潔凈區域中分離的與不良趨勢相關的微生物對該潔凈區域中所使用的消毒劑的敏感性。
美國注射劑協會（Parenteral Drug Association，PDA）第13號技術報告《環境監控計劃基礎》[7]在清潔消毒程序中明確要求，應使用微生物降低的挑戰試驗來證明消毒程序。推薦使用來自環境監控程序所分離的常見微生物對所選的消毒劑進行挑戰試驗，來證明消毒劑的實際有效性。
美國材料協會的《潔凈室消毒劑的評估標準指南》[8]專門對環境分離菌在消毒劑效果確認試驗中的使用進行了論述，該指南首先指出法規和監管部門已經明確，應將環境分離菌應用于消毒劑效果確認中，并引用了FDA2004年無菌生產工藝指南。該指南還指出，沒有必要包括所有的分離菌，但是有必要在選擇試驗菌時建立有效的基本原則。其基本原則是使消毒劑的消毒效果能夠達到控制潛在污染微生物風險的目的。
二、 抑菌效力試驗
為了防止藥物制劑在正常貯藏或使用過程中，因微生物的污染和繁殖使藥物變質而對使用者造成危害，如果制劑本身沒有充分的抗菌效力，應根據制劑特性添加適宜的抑菌劑，尤其是多劑量包裝的制劑。在添加抑菌劑的同時，應考慮到抑菌劑的毒性，保證用藥安全。因此，成品制劑中的抑菌劑有效濃度應低于對人體有害的濃度，從而達到“最低”“有效”的目的[1]。因此，需要在制劑研發和穩定性試驗中進行抑菌效力檢查，測定無菌及非無菌制劑的抑菌活性。抑菌效力檢查方法的基本原理都需要在藥物制劑中加入菌液，放置一定時間后再進行活菌數測定，根據菌數對數值的下降來判斷其抑菌效力。
《中國藥典》四部通則《1121抑菌效力檢查法》[1]中明確要求，若需要，制劑中常見的污染微生物也可作為試驗菌株，例如含高濃度糖的口服制劑還應該選用魯氏接合酵母為試驗菌株。美國藥典、歐洲藥典和日本藥典的抑菌效力檢查方法中也有類似的描述。
洋蔥伯克霍爾德菌，并將該菌作為挑戰菌應用到不同濃度的苯扎氯銨防腐體系中的抑菌效力評價，這表明在特定環境下的野生菌株對抑菌劑的耐受性有可能會高于實驗室培養基菌株，在進行防腐劑或抑菌劑效力評價時，應考慮加入環境或樣品中的常見分離菌作為挑戰菌[9]。
三、 培養基適用性（促生長試驗）
各國藥典都要求對微生物檢驗用培養基進行適用性試驗（或稱為促生長試驗），其目的是確認培養基能夠使目標微生物生長，從而保證在檢驗時能夠檢出實際可能污染的微生物。各國藥典的檢查法中一般都只要求使用標準菌株進行培養基促生長試驗，但是在藥典指導原則和行業指南中都提出了可以加入環境分離菌。此處的環境分離菌可解釋為檢驗對象及環境可能存在的微生物，例如基于歷史數據的環境菌庫中的常見菌、樣品常見污染菌等。
美國FDA于1993年發布《藥品質量控制微生物實驗室檢查指南》[10]，用于指導檢查員對微生物分析實驗室的檢查。指南中提出，應定期用低水平的微生物對所制備的培養基進行挑戰，包括使用美國藥典規定的指示微生物以及日常環境菌。
我國國家藥品監督管理局發布的《無菌工藝模擬試驗指南（無菌制劑）》[11]、FDA2004年無菌生產工藝指南[6]、PDA第22號技術報告[12]均要求，在無菌工藝模擬試驗（培養基模擬灌裝）的培養基促生長試驗中，使用藥典規定的標準菌株的同時，也應考慮使用環境監控和無菌檢查中分離的污染菌。
美國藥典43版《1116無菌生產環境的微生物控制和監控》[2]中提出，在進行環境監控用培養基的促生長試驗時，所使用的菌株應包括環境監控分離菌。
《中國藥典》2020年版四部通則《9203藥品微生物實驗室質量管理指導原則》[1]和美國藥典43版《1117微生物實驗室良好操作規范》[2]對培養基具有質量控制的要求，在選擇藥典規定的菌株同時也可以增加環境分離菌和產品中常見的污染菌株。
國際藥品檢查組織（Pharmaceutical InspectionConvention and Pharmaceutical Inspection Cooperation Scheme，PIC/S）2011年發布的《無菌工藝驗證的建議》[13]對培養基的要求中提出，選擇的培養基應能夠支持廣泛的微生物生長，這些微生物可能會存在于生產環境中，應基于企業的環境菌庫（例如來自環境監控的微生物）來選擇。
本研究團隊曾經在胰酪大豆胨瓊脂培養基（Trypticase Soy Agar，TSA）的質控過程中使用人參土芽孢桿菌[14]。在日常微生物檢測過程中發現不同廠家的TSA對某藥用輔料污染微生物的檢出能力經常出現較大的差異，通過對污染微生物進行分離和鑒定，確定該微生物為人參土芽孢桿菌。進一步研究發現，該菌的生長受TSA的影響顯著。與藥典規定的標準菌株相比，該菌具有更好的篩分能力，在培養基適用性試驗中增加使用人參土芽孢桿菌，可以提高現行培養基適用性試驗結果的可靠性。
四、 檢驗方法的適用性
目前，各國藥典在微生物檢驗的方法適用性中均未要求使用環境或樣品分離菌。但是，樣品本身的污染菌在檢驗條件下能否生長受到多種因素影響，本研究團隊曾經研究屎腸球菌對復方胰酶散微生物計數方法適用性試驗中試驗菌生長的影響，結果表明，使用傾注法時試驗細菌的回收率偏低，其原因是樣品本身所含屎腸球菌的生長導致瓊脂培養基pH值下降，從而抑制了加入的試驗細菌的生長[15]。本研究團隊在某中藥顆粒劑的微生物限度檢驗時發現，使用平皿法（1mL·皿-1）按照《中國藥典》規定的幾株標準菌株進行方法適用性均能夠達到對回收率（50%~200%）的要求，但是樣品污染菌的檢出情況各稀釋級間不能達到10倍數量關系，懷疑該方法不能有效檢出污染菌，進一步使用薄膜過濾法（1mL·膜-1，100mL·次-1，沖洗2次）才能使檢驗結果更能反映樣品的污染情況。最終選擇使用薄膜過濾法對該中藥顆粒劑進行微生物限度檢查。因此，在檢驗方法的適用性試驗和方法轉移確認時，應注意檢驗方法對實際污染微生物的檢出能力和回收率。
在檢驗方法的適用性試驗方面，可以根據樣品本身特點和容易污染菌的種類，考慮增加環境分離菌作為方法適用性研究的試驗菌。例如某重組生物制品原液，企業在原液生物負載檢驗方法的適用性試驗中，除了使用藥典規定的標準菌株外，還增加了環境菌株，包括表皮葡萄球菌（人員分離菌），皮氏羅爾斯通氏菌（水系統分離菌）和蘇云金芽孢桿菌（環境分離菌），這樣建立的方法更有利于實際污染菌的檢出。
五、快速微生物檢驗方法和微生物檢驗替代方法驗證
FDA2008年發布的《細胞和基因治療產品基于快速微生物方法的無菌檢查方法驗證指南》[16]中對快速微生物檢驗方法（Rapid MicrobiologicalMethod，RMM）驗證用菌株進行明確要求：應根據RMM在產品和工藝中的性能表現建立一組微生物，應包括革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、需氧菌、厭氧菌、酵母、霉菌、原輔料分離微生物、中間產品分離微生物、環境監控分離微生物、生產區域分離代表低營養高應激環境的微生物、生長緩慢微生物（例如痤瘡丙酸桿菌）、對于RMM需要復雜營養的微生物和文獻報道特定產品類型中常見分離菌等。
PDA技術報告第33號《新的微生物檢驗方法的評估、驗證和實施》[17]提到，應根據每一種驗證參數的評估選擇有代表性的菌株進行試驗。用戶應考慮使用應激狀態的微生物。應激狀態的微生物可以根據實際情況，將菌株的培養物暴露于一定環境條件（例如紫外線、熱、冷、高滲等條件）、抑菌作用（消毒劑、藥物作用）或亞致死滅菌條件下得到。在專屬性試驗中應使用實驗室的標準菌株以及環境分離菌株，中間產品和無菌檢查陽性分離菌株，以及生長緩慢、苛養、厭氧和臨床分離菌株。在將替代方法或快速微生物檢測方法應用到本地實驗室時，在性能確認（PQ）環節應注意使用本實驗室或本企業的有代表性的環境分離菌。
《中國藥典》2020年版四部通則《9201藥品微生物檢驗替代方法驗證指導原則》[1]中提到，在微生物定性檢驗方法的專屬性試驗中，當進行控制菌的檢驗時，還應選擇與控制菌有類似特性的菌株作為驗證對象。美國藥典43版1223《微生物替代檢驗方法的驗證》[2]中也提到，在專屬性試驗時，使用包括一定數量的能夠代表患者或產品風險的微生物，包括生產環境分離微生物、產品污染微生物。
六、環境分離菌的選擇和使用原則
做好環境菌在藥品微生物檢驗中的應用，一是應建立科學合理的環境菌收集、鑒定和保存方法規程，建立有代表性的環境菌數據庫，并且定期做好數據分析和回顧工作。藥品生產過程中的污染微生物可能來源于從原輔料到終產品的整個過程，環境分離菌的選擇應充分理解藥品生產工藝以及相關因素，藥品生產過程中可能污染微生物的來源分析見圖1[18]。本研究團隊在之前發表過若干研究論文，包括環境菌庫在制藥行業的應用[19]、無菌藥品生產企業的環境菌分離和鑒定情況[20]、制藥環境用消毒劑對環境分離菌殺滅效應的比較研究[21]等內容。PDA第13號技術報告[7]詳述了環境監控策略和環境菌的收集鑒定和分析策略。當然，此處的“環境菌”并不只是生產環境分離菌，還包括原輔料、中間產品、終產品的生物負載監控或微生物檢驗分離的微生物、終產品無菌檢查陽性和培養基模擬灌裝陽性分離微生物等。
二是應根據檢驗項目、藥品的生產工藝和產品本身的特點，在風險評估的基礎上選擇適當的環境分離菌應用于適當的檢驗過程中[18]。有的檢驗項目用于分析高負載條件下微生物數量下降的情況，例如抑菌效力試驗、消毒劑效能驗證試驗等；有的檢驗項目是分析低負載水平條件下的微生物的數量，例如生物負載監測、環境監控、微生物限度檢查等。在藥品生產工藝和質量控制的不同環節，對分離微生物有不同的應用。例如，某企業在環境菌年度分析中發現，在每年的春夏季在潔凈區的環境監控之中會出現霉菌的檢出，而在別的季節則沒有發現霉菌。那么，在對分離的霉菌進行分離和鑒定之后，可以將霉菌應用于目前使用的消毒劑的效能驗證，以研究目前的消毒劑使用和清潔消毒規程是否對這種霉菌仍然有效。當然，該霉菌亦可用于環境監控的培養基的促生長試驗，以證明目前的環境監控方法能夠在低負載水平情況下檢出這種霉菌。
三是根據微生物數據偏差（Microbial DateDeviation，MDD）調查結果，將分離微生物應用于相應的檢驗之中[18]。例如，某非無菌藥品的終產品微生物限度檢出過程中分離出一株不可接受微生物陰溝腸桿菌。如果經過調查該株微生物是來源于某輔料，則應將該菌應用于輔料檢驗的培養基適用性試驗之中。如果經過調查發現該株微生物室來源于生產過程中的人員，則應將該菌應用于人員的表面微生物監控培養基的適用性試驗之中。
七、 結論
一般來說，各國藥典要求在藥品微生物檢驗中使用標準菌株來進行方法驗證或結果判斷。但是，藥典指導原則和行業指南中又要求或建議在微生物檢驗中增加使用環境分離菌（包括生產檢驗過程中人員、環境以及樣品中分離菌）。與標準菌株相比，環境分離菌更能夠反映樣品或環境實際存在微生物的情況，使檢驗結果能夠對產品質量或環境做出更客觀和科學的評價。本文就環境菌在消毒劑效能驗證、抑菌效力檢查、培養基方法適用性（培養基促生長試驗）、檢驗方法的適用性、快速微生物檢驗方法和微生物檢驗替代方法驗證等方面的應用進行了各國藥典和指南的綜述，并提出了環境分離菌的選擇和使用原則。希望本文能夠引起藥品研發、檢驗、監管和質量控制人員的對環境分離菌作用和應用的思考，在風險評估的基礎上考慮環境分離菌的應用，使藥品微生物檢驗結果更具針對性、能夠反映實際污染情況、能夠反映生物負載的實際下降情況，使藥品微生物檢驗更好的服務于藥品的質量控制。
