近期，美國斯蒂文斯理工學院王紅軍教授和南開大學朱美峰研究員在Bioactive Materials上聯合發表研究文章：通過3D打印聚電解質復合物制作用于組織再生的多孔道生物支架。限制組織工程臨床轉化的關鍵因素之一，是無法創建大體積并擁有復雜三維結構的再生組織。在這里研究者通過嵌入式3D打?。‥B3DP）聚電解質復合物（PEC）和澆鑄的方法，實現了在支架內創建微通道網絡。

01研究內容簡介

在體外制造組織工程構建物或在體內進行病變或受損組織的修復時，支架引導的組織再生仍然是主流。通常情況下，由不同材料制成的支架將為貼附細胞創造一個適宜的生長微環境。一般來說，這種支架應具備一個相互連接的孔道網絡，孔道具有理想的尺寸、精巧的分層結構和優化的生物學分區。具備孔道的生物支架材料不僅能促進可控的細胞活動（如附著、遷移和分化），并且能在新組織形成期間帶來充足的營養供給。越來越多的證據表明，在支架設計中納入結構的復雜性可以更好地模仿細胞外基質（ECM）的獨特機械和生物功能，并在空間中引導形成具有取向性的生物組織，如血管和神經元網絡。

因此，本研究打算開發一種廣泛適用的方法，探索使用聚電解質復合物（PEC）作為打印墨水，生產制備具有任意形態的可犧牲模板支架，并廣泛匹配各種澆鑄材料（如聚合物熔體、合成和天然聚合物溶液、熱敏水凝膠和光交聯水凝膠），通過PEC對外部刺激（如pH值和離子濃度）的敏感解離反應，制造出含有三維分層和任意通道結構的生物支架（圖1）。這項研究不僅證明了在生物支架內創建分層通道網絡的可能性，而且還提供了一個有效的途徑來快速可重復地設計孔道結構，以便在組織工程領域對具有各向異性和復雜性的細胞進行空間引導再生。

圖1. 通過3D打印的可犧牲聚電解質復合物（PEC）模板輔助策略，形成具有三維分層、任意構型的多功能孔道支架的關鍵步驟示意圖。

一、可打印的PEC墨水的制備與表征

聚（二烯丙基二甲基氯化銨）（PDADMAC）和聚（4-苯乙烯磺酸鈉）（PSS）的聚電解質被認為是一個充滿潛力的PEC耦合對，它們表現出良好的結合強度、快速的結合速率、對離子強度的敏感性（結合/解離）、對高溫的耐受性（高達350℃）、相對較高的硬度（∼10MPa）和可忽略的細胞毒性。如圖2A所示，將PDADMAC和PSS以單體單位2.50M的濃度以1:1的體積比混合，通過內在的靜電相互作用可以導致快速結合（<1分鐘）生成PEC。從理論上講，許多類型的鹽可以用來部分或完全解離PEC，并呈現可調節的粘度。解離速度主要依賴于生成PEC的電解質耦合對的強度、離子擴散系數和鹽的解離速度。溴化鉀（KBr）在本研究中被特別選擇，因為它被證明有能力比氯化鈉更快地達到摻雜平衡。如圖2B所示，隨著KBr濃度的增加，PDADMAC/PSS復合物逐漸被來自PEC "外在位點 "的反離子（即K+和Br-）補償。在較低的KBr濃度（≤1.50M KBr）下，PEC被塑化，同時保持物理上的完整。當KBr濃度增加到1.75M時，PEC變成了一種粘稠的液體（稱為 "共析物"），其粘度適合于擠出打印，不會因為剪切引起的壓力下降而堵塞打印噴頭（圖2C）。隨著KBr濃度的進一步增加（≥2.00M KBr），PEC中預耦合的PDADMAC/PSS被KBr離子完全解離，形成一個均勻的溶液。鑒于PEC（PDADMAC/PSS）通過添加水或高濃度KBr可逆的沉淀/溶解機制，它不僅提供了一個可控的方法來調節PEC墨水的粘度以便進行3D打印，而且還提供了一個方便和 "綠色 "的手段來去除和回收作為犧牲模板的PEC支架。如圖2D所示，PEC支架可以迅速溶解在2.00M的KBr溶液中，并在降低KBr濃度后重新沉淀。在離心和清洗后，沉淀的PEC可以被收集并重新溶解在1.75M的KBr中，形成可打印的凝聚物，使環保和成本效益達到了平衡。

圖2. PEC打印墨水關鍵參數優化和PEC可犧牲模板的回收過程。A）用于嵌入式3D打?。‥B3DP）的PEC墨水的制備示意圖。B）不同濃度KBr水溶液中PEC沉淀物溶解的宏觀圖像。C) 溶解在不同濃度的KBr溶液中的PEC的流變曲線。D) 3D打印的PEC模板的完整回收過程。

二、在Pluronic 127水凝膠中進行嵌入式3D打印制備PEC可犧牲支架

為了利用嵌入式3D打印制備任意形貌的PEC可犧牲支架，研究者利用了三嵌段共聚物Pluronic F127的熱可逆凝膠行為，使其扮演打印支撐基質（圖3A）。25%（w/v）的Pluronic F127水溶液可在室溫（臨界點溫度為22℃∼）下凝膠化，同時表現出 "剪切稀化能力"，即為水凝膠剪切應力因移動的打印噴頭的剪切速率增加而急劇下降。在這方面，研究者測試了與剪切應力有關的儲存模量的變化。如圖3C所示，25%（w/v）的Pluronic F127（約30千帕）的儲存模量隨著剪切應力的增加而減少，這表明快速移動的打印噴頭能通過剪切稀化作用使水凝膠局部液化，而隨著打印停止，Pluronic 127可以恢復凝膠狀態。另一方面，25%（w/v）的Pluronic F127剪切稀化特性也賦予了它自我修復的能力，可以立即填補打印噴頭快速移動造成的空隙，進而防止印刷結構因噴頭移動而發生潛在的變形（圖3B）。同時，Pluronic F127中存在水分也能使得打印的PEC快速凝固成型。此外，Pluronic F127的熱響應相變將允許其在臨界溫度下迅速轉化為水溶液以釋放打印的可犧牲支架。

嵌入式3D打印的可控性和其他相關的邊界條件也在文中得到了逐一探究。圖3B示意性地說明了嵌入式3D打印的的裝置，其中PEC墨水以泵送速率Vp從一個內徑為Dn，移動速度為Va的打印噴頭（26G）中擠出。由于其自身彈性和擠出的PEC的相關剪切稀化作用，預計會出現模具膨脹，即打印的纖維直徑D'大于Dn。這種模脹現象無疑會限制纖維直徑D'的大小，從而限制了打印的分辨率。幸運的是，這樣的問題可以通過在嵌入式3D打印過程中，在25%（w/v）Pluronic F127內塑化和拉伸PEC來部分克服。如圖3E所示，由于PEC和25%(w/v)的Pluronic F127之間不均勻的離子交換，凝固的PEC層會瞬間形成，包裹住擠出的PEC墨滴。同時，PEC墨水和Pluronic F127支撐基質之間的內在彈性模量差異允許將打印的PEC拉伸成具有均勻直徑D的纖維，這一過程也促進了離子擴散，以防止串珠或拖尾結構的形成（圖3D）。最終，塑化/拉伸的穩定狀態達成，其水含量、重新耦合的PEC對和周圍的反離子（圖3E）達到微妙的平衡。這保證了制造出具有高保真度和良好機械穩定性的PEC可犧牲支架。研究還發現，通過分別調節Va和Vp，進而可以控制打印纖維的粗細與形態（圖3F與3G）。例如，當Vp/Va比率大于0.67μL mm-1時，由于印刷速度相對較慢，過多的PEC會積聚在打印噴頭的尖端，導致打印結構的破壞。相反，當Vp/Va比值低于0.008 μL mm-1時，過快的噴頭移動會將有限的PEC拖過支撐基體，導致扁平的纖維甚至串珠的形成。

圖3. 與制造PEC可犧牲模板有關的關鍵參數的優化。A）自制的3D打印機和嵌入式3D打印的示意圖。B)嵌入式3D打印過程示意圖。C）兩種濃度的Pluronic F127在室溫下的流變特性。D) 三個打印邊界條件的示意圖。E）在PEC打印纖維的形成過程中，25%（w/v）水溶液中的反離子、水和PEC耦合對的再平衡的示意圖闡述。F）Va和Vp的彩色編碼圖與PEC可打印性。G）1.75M KBr PEC共析物的纖維直徑與Vp/Va比值之間的相關性。

本研究還探索了打印各種疊加角度（15°、30°、45°、60°、75°和90°）（圖4Ca-f）、復雜圖案（三角形、波浪形和蜂窩狀）（圖4Cg-i）和多層疊加（圖4Cj-l）的PEC纖維結構。特別是，多層PEC蜂窩圖案是以大尺寸（2厘米×2厘米×0.3厘米）連續和逐層打印的。每一層都有清晰的邊界（圖4Cl），這表明嵌入式3D打印可以隨時擴大規模，生產大型復雜的結構。與水凝膠和基于糖熔體的結構相比，打印的PEC結構表現出適度的機械強度和良好的靈活性。對干燥的10層PEC網格（圖4Da）進行循環壓縮試驗，以90°覆蓋角從頂部或側面加載（圖4Db-c），證明了其從變形中恢復的能力，并沒有產生分層或結構崩潰。除了干燥狀態，濕的6層PEC蜂巢結構也通過用鑷子手動折疊來評估其彈性和結構穩定性（圖4E）。事實上，這里所測試的性能對于在不同的澆鑄材料上使用打印的PEC構作為犧牲模板是至關重要的。

圖4. 在嵌入式3D打印過程中，PEC微纖維的不同空間構型和相關的機械穩定性。A) 各種纖維直徑和纖維間距離的立體顯微鏡圖像。比例尺：a）500μm；b）200μm。B）PEC纖維的SEM顯微照片。L-a）從1.75M KBr PEC共析物中打印的纖維的形態（L-b）。從1.75M KBr PEC共析物中提取的直徑為L-c)120 μm、L-d)200 μm和L-e)500 μm的PEC纖維的橫截面。比例尺：a）200μm；b）50μm；c）20μm；d）50μm；e）100μm。C) 15°到90°不同疊加角度的PEC纖維的立體顯微鏡圖像，復雜的圖案和多個疊加層。比例尺：a-i）500μm；j-l）2mm。D) 在干燥條件下的打印PEC可犧牲模板的特征。D-a）干燥的PEC模板。D-b）在循環壓縮測試下，干燥的PEC模板的機械穩定性的宏觀演示。D-c）干燥的PEC可犧牲模板在第1個（藍色）和第20個（紅色）壓縮周期后的應力-應變曲線。E）濕的PEC可犧牲模板的宏觀視圖（a）沒有折疊（b）和折疊（c），以顯示結構的完整性。

三、在聚(1, 8-辛二醇-檸檬酸)(POC)鑄模內形成微通道網絡

鑄模內互連通道的形成受到打印分辨率、結構穩定性和犧牲模板的可移除性等影響（圖5A）。因此，本文試圖確定打印的PEC結構是否適合作為可犧牲模板，在聚（1，8-辛二醇-檸檬酸）（POC）鑄模內形成可灌注的開放微通道。為了更好地觀察POC鑄模內的PEC可犧牲模板，在SEM下檢查了其橫截面?？梢院苋菀椎刈R別出PEC纖維，并看到了從圓形到橢圓形的變形（圖5Ba-b），這很可能是由于高溫和真空引起的PEC纖維的脫水。PEC去除所需的時間取決于PEC耦合對和反離子。實驗使用了PDADMAC/PSS和2.00M KBr，PEC模板從POC鑄型中溶解出來的時間為幾分鐘。在2.00M的KBr水溶液中浸泡15分鐘后，PEC模板從POC鑄型中完全去除，并通過SEM檢查確認其橫截面，并形成開放的微通道（圖5Bc-e）。正如證實的那樣，這些微通道在疊加的PEC纖維的交界處連接良好（圖5Bc）。為了更好地評估微通道結構的互連性和質量運輸的效率，通過通道POC鑄型底部的開口注入庫馬西亮藍溶液（0.025%，w/v）（速度為2 mL h-1）（圖5Ca）。染料在整個通道中的時間分辨滲透很容易以逐層的方式發生（圖5Cb）。同樣地，具有其他形貌的打印PEC可犧牲模板也被測試了其在POC鑄型內產生多功能開放通道結構的能力（圖5D）。在移除PEC模板后，微通道彼此連接良好，并可灌注染料溶液（圖5Da-iv-d-iv）。為了更好地觀察管腔的空間組織，還對有通道的POC支架進行了Micro-CT分析。如圖5E所示，這些由PEC模板（紅色標記）形成的微通道顯示出三維分層結構，與AutoCAD的設計高度。這些結果顯然表明，在打印出來的PEC可犧牲模板的幫助下，一個三維復雜的微通道網絡可以有效和可靠地在POC鑄件內形成，并可能允許通過生理相關的灌注進行自由質量/氧氣運輸。

圖5. 具有不同形貌的多功能孔道網絡的POC支架的形成。A）PEC可犧牲模板在POC鑄型內形成相互連接的通道網絡的示意圖。B）在去除PEC可犧牲模板前后，帶有微通道的POC鑄型的橫截面的SEM顯微照片。比例尺。100μm。C) 表征POC鑄模內相互連接的微通道的滲透性，其中C-a)中說明了實驗設置，C-b)中顯示了染色溶液（藍色）通過通道的延時滲透。比例尺：200μm。D) 具有不同通道結構的孔道POC支架的顯微圖像（a-iii至d-iii）和滲透性（a-iv至d-iv），這些支架是通過將PEC模板（a-i至d-i）從PEC/POC鑄模（a-ii至d-ii）中移除而產生的。比例尺：a-b) 200 μm；c-d) 500μm。E）根據Micro-CT掃描的俯視圖（a-ii至b-ii）和側視圖（a-iii至b-iii），確認在POC（黃色）內形成與原始設計（a-i至b-i）類似的理想的開放微通道（紅色）。

四、利用PEC可犧牲模板在不同的可澆鑄材料中形成微通道

為了進一步確定這種PEC可犧牲模板方法的靈活性和通用性，我們探索了其他常用的天然（如瓊脂糖和膠原蛋白）或合成（如GelMA和聚苯乙烯）材料中創造可灌注的微通道（圖6A）。更重要的是，這些澆鑄材料，依靠不同的方式來凝固（即pH值和熱反應的凝膠化，紫外線誘導的交聯，以及有機溶劑蒸發），并沒有對PEC模板（即5層90°覆蓋的網格）造成明顯的破壞（圖6Aa-d-i&ii）。用2.00M的KBR溶液浸潤這些支架以溶解PEC可犧牲模板后，并不影響通道支架的結構完整性。與POC類似，用瓊脂糖也觀察到熱誘導的微通道變形（圖6a-iv）。相比之下，其余材料都獲得了圓形通道（圖6Aa-d-iii和-iv）。有趣的是，根據澆鑄材料的不同，觀察到PEC纖維（直徑200微米）的微通道的收縮率不同。用ImageJ分析顯微鏡圖像，發現瓊脂糖的收縮率最高（10.4%），其次是聚苯乙烯（PS，7.2%）、GelMA（5.3%）和膠原蛋白（3.7%）（圖6B）。注意到的微通道尺寸的變化很可能是由于在澆鑄材料的凝固過程中印刷的PEC模板的失水造成的。顯然，與水凝膠（GelMA和膠原蛋白）相比，有機溶劑蒸發（PS為氯仿）和高溫處理（瓊脂糖為120℃）將不可避免地減少PEC模板的水含量。盡管有收縮，但PEC模板始終支持在這些基質中發展開放和相互連接的微通道。據我們所知，沒有其他報道的犧牲性模板證明與如此廣泛的可澆鑄材料兼容。此外，PEC模板的通道形成也可以很容易地與其他致孔的方法（如凍干、氣體發泡和顆粒浸出）相結合，以制造出在孔隙中具有相互連接的分層通道的支架（圖6Ca）。例如，在凍干和戊二醛交聯后，將PEC模板從40%（w/v）的絲纖維素（SF）中移除，可以在SF基質的微米和亞微米大小的孔隙（2-20μm）中形成微通道（圖6Cb-c）。同樣，在凍干后，交聯的10% GelMA微米大小的孔隙（40-80μm）中可以形成PEC誘導的微通道（圖6Ce）。結果支架的MicroCT分析顯示，SF支架（76±2%）和GelMA支架（79±3%）的孔隙率相當（圖6D）。

圖6. 由多功能可鑄生物材料形成的通道支架。A）在（a-i&ii至d-i&ii）和（a-iii&iv至d-iii&iv）去除PEC可犧牲模板之前和之后，由瓊脂糖（Aa）、甲基丙烯酸明膠（GelMA）（Ab）、膠原蛋白（Ac）和PS（Ad）制備的通道支架的顯微鏡圖像。B）去除PEC后不同材料內的通道收縮量的量化。(n≥5，*p＜0.05，**p＜0.001，NS：不顯著）。C) 通道網絡的發展與其他致孔方法（如顆粒浸出、凍干、氣體發泡）相結合（Ca），形成具有多尺度多孔結構的通道支架，如凍干后的SF（Cb-d）和GelMA（Ce-f）。嵌入SF澆鑄材料中的PEC模板的SEM顯微照片（Cb-i和ii），以及與沒有通道的SF凍干支架（Cd）相比，去除PEC模板后凍干孔隙中形成的微通道（Cc-i和ii）。具有額外凍干孔的通道GelMA支架的SEM顯微照片（Ce-i和ii），與沒有通道的支架不同（Cf）。比例尺。100 μm。D) 通過Micro-CT掃描確定，帶有凍干孔的GelMA和SF微通道支架的孔隙率具有可比性。(n≥5，NS：不顯著）。

五、孔道支架的體外組織形成

在凍干絲素蛋白的支架中引入微通道，預計不僅能促進其與外界質量交換，還能支持細胞浸潤和組織形成。這里，我們選擇了三種具有不同通道直徑（CD）（200或400微米）和通道間距離（ICD）（600或800微米）的絲素蛋白支架來證明微通道能促進組織的形成。在體外細胞培養方面，用小鼠成纖維細胞（STO細胞，1×105細胞/支架）動態播種，然后在生物反應器中連續攪拌培養（圖7A），這表明它有能力實現細胞在支架之間的均勻分布，并支持細胞的持續增殖和ECM沉積。培養的生物支架橫截面的H&E染色也顯示出更多的細胞和新組織位于內部孔隙中，主要通過微通道生長（圖7D）。為了更好地觀察新的ECM沉積，還用Masson's三色染色法對膠原蛋白進行了染色。如圖7E所示，新合成的膠原蛋白（藍色）的沉積只發生在非通道的SF支架的外圍區域。雖然非通道SF支架的微孔有利于質量交換，但其尺寸可能太小，細胞無法浸潤。相反，在另一組的整個微通道中看到了大量的膠原蛋白，證實了這種微通道在促進質量交換和支持新組織形成方面的高效。

圖7. 小鼠成纖維細胞（STO細胞）在有通道和無通道的SF支架內進行體外培養，以評估其對組織形成的支持性。A）細胞播種和在生物反應器內的連續培養條件的示意圖。B) 培養1、7和14天后，STO細胞在支架B和非通道對照內的附著和增殖的定量分析。細胞增殖是通過MTS檢測間接測量的。(n≥5，*p＜0.05，NS：不顯著）。C）用于創建不同通道支架的PEC可犧牲模板（A，B，C）的形態。 ai-ci）PEC可犧牲模板的SEM顯微照片。比例尺：200μm aii-cii) PEC可犧牲模板的立體顯微鏡圖像。比例尺：500μm。表2總結了不同支架的關鍵屬性。D) 培養的生物支架的H&E染色橫截面的代表性顯微圖像，顯示了非通道對照（Da）和支架B（Db）在培養1、7和14天后的細胞分布和組織形成。比例尺：200μm。 #：通道的橫截面。黑色箭頭：細胞和新形成的組織。D) 培養的生物支架Masson's三色染色橫截面的代表性顯微圖像，以更好地顯示非通道對照（Ea）支架B（Eb）內新合成的膠原蛋白（藍色）以及培養7天和14天后的情況。比例尺：200μm。 #：通道的橫斷面。

六、孔道支架的體內組織再生和血管化

為了評估孔道支架對組織生長的功效，并探索各種配置（即CD和ICD）與細胞化、血管化和免疫調節的相關性，研究選擇了通道式SF支架（支架A、B和C）和非通道式SF支架（對照組）皮下植入Sprague-Dawley大鼠的背部（圖8A）。植入2周和4周后的外植體的組織學分析（H&E染色）顯示，通道支架的組織主要通過通道生長，這在支架A（圖8Bb）中很明顯，該支架有一個小的CD（200μm）和大的ICD（800μm）。增加CD（支架C）或減少ICD（支架B）能夠明顯促進組織的生長（圖8Bc和d）。非通道支架上的組織生長極少，只在表層區域或支架周圍發生（圖8Ba）。與非通道支架或支架A內有限的微血管相比，支架B和C內的微血管數量增加（黃色箭頭）。為了更好地觀察血管，還進行了Von Willebrand因子（VWF）的免疫熒光染色。如圖8中的黃色箭頭所示，更多的毛細血管通過支架B和C的微通道形成。顯然，細胞浸潤和血管化都與相互連接的微通道和增加的孔隙度有很好的關聯。在體內植入任何異物都會不可避免地誘發入侵的巨噬細胞的極化，即iNOS陽性的促炎癥巨噬細胞（M1）或CD206陽性的抗炎癥巨噬細胞（M2）。植入4周后，這些標記物的免疫熒光染色證實，CD206和iNOS陽性細胞分布在整個通道支架的微通道內（圖8D）。相比之下，巨噬細胞主要分布在非通道式支架的外圍邊界區域。圖像分析進一步顯示，通道化支架中CD206陽性細胞的數量明顯高于非通道化對照組，而通道化支架中iNOS陽性細胞的數量與對照組支架接近。這些數據表明，通道化的SF支架具有更好的免疫調節和生物相容性。到目前為止，所有的結果都證明了通道式支架在通過鼓勵細胞化和血管化來促進組織生長方面的優越性。

圖8. 在體內植入各種有通道和無通道的SF支架以評估微通道對組織生長的影響。A）實驗裝置的示意圖，其中通道支架（支架A、B和C）或非通道支架（對照）被植入大鼠的皮下。B）皮下植入2周（Ba-i至Bd-i）和4周（Ba-ii至Bd-ii）后，外植體的H&E染色截面的代表性顯微鏡圖像。比例尺：200μm。#：通道的橫截面。黑色箭頭：新形成的組織。黃色箭頭：新形成的毛細血管。C）皮下植入2和4周后，不同支架內組織生長的半定量表征。(n≥5，*p＜0.05，**p＜0.001，NS：不顯著）。D) 對vWF（綠色）和DAPI（藍色）進行免疫熒光染色后，新血管形成的外植體截面（Da-i至Dc-i）的代表性熒光圖像。炎癥性巨噬細胞（Da-ii至Dc-ii）在免疫熒光染色iNOS（紅色）和DAPI（藍色）標記后，以及抗炎性巨噬細胞（Da-iii至Dc-iii）在免疫熒光染色CD206（綠色）和DAPI（藍色）標記后。比例尺。100 μm。 #：通道的橫切面。黃色箭頭：新形成的毛細血管。

最后，作者指出，PEC生物墨水和Pluronic F127支持基質在嵌入式3D打印中的優化組合可以確定幾個相關的創新，包括1）在高打印分辨率下形成復雜的多層結構，2）相對較低的規?；系K，以及3）制造過程中強大的容錯性。分層通道網絡在體外和體內表現出良好的通暢性，能促進質量交換以維持高細胞活力，并在皮下植入后促進組織再生和整合。這樣的孔道支架將大大有利于生理相關組織的形成，可以用于體外測試組織模型或體內重建手術。