共線生產需要滿足的一個硬指標就是清潔驗證，清潔驗證通過的產品可以順利共線生產。但是因為清潔的限度低、產品的性質差異等對于分析方法的開發存在一定的挑戰。清潔驗證的分析方法開發的思路和方式直接關系方法的驗證通過性，本文通過實例分享來助力同行對清潔驗證分析方法開發的一般了解。

01.清潔限度的確認

一清潔限度的常用三種計算公式如下：

1.10ppm法：

2.基于治療量的1/1000法：

3.PDE法：

二待清潔產品的限度計算：

需要根據共線產品的排列組合，并分別采用以上三種計算公式，最后計算出擬進行清潔分析方法開發的產品的限度。

舉例：生產線中，共線品種為A和B，其中A為清潔分析方法開發的目標產品，B的最小批量為50L，A的最小日劑量10ml（100mg），B的最大日劑量2ml（50mg），生產中接觸配液罐10300cm2，配液管線7700cm2，灌裝管線500cm2，A的PDE值為2.5μg/天。

計算A的允許最大單位殘留量：

1. 10ppm法為：27.03μg/ cm2

2. 基于治療量的1/1000法為：0.14μg/cm2

3. PDE法為：3.38μg/ cm2

因此，A的允許最大單位殘留量為：0.14μg/cm2

2.方法開發要點

一方法限度的確定

首先，需要確認的先決條件包括：

擦拭法：擬應用的涂布面積（即擦拭的面積）和提取應用溶劑的量。

舉例：擦拭面積為100cm2，提取溶劑為50ml，計算A的清潔驗證擦拭限度：

擦拭限度計算得：0.28μg/ml

淋洗法：取樣中清潔溶劑的用量。

舉例：取樣中清潔溶劑的用量為50L，計算A的清潔驗證擦拭限度：

擦拭限度計算得：0.052μg/ml

注：一般為了分析方法的檢出能力更強，結合預實驗中擦拭和淋洗的回收率考察結果，針對于擦拭限度和淋洗限度可以加適當的系數進行校正，如系數為75%，那么本例中的擦拭和淋洗限度分別為0.21μg/ml和0.039μg/ml。

二方法定量限的考察

清潔驗證中產品A的殘留量，本質是針對A的含量測定，一般可以首選含量測定的方法，并且于在確定擦拭和淋洗的限度后，采用擬定的含量測定的方法考察定量限，方法的定量限的一般可接受標準為擦拭或淋洗限度（二者較小者）的20%，至少達到50%。

三擦拭回收率的考察

首先，需要確認的先決條件包括：

清潔溶劑：需確認產品的溶解性，在水中的溶解性和酸或堿中的溶解性。

擦拭溶劑：如水、醇、酸或堿等對待清潔的產品有足夠的溶解能力的溶劑。

提取溶劑：如方法條件中的稀釋劑、水、有機相或特定的溶劑等，需要根據待清潔的產品的性質有針對性的選擇。

擦拭棉簽的數量：需要設計不同數量的擦拭棉簽考察回收率的變化情況。

擦拭棉簽的溶劑浸潤體積：不同浸潤體積對擦拭回收率的影響較大，可以結合棉簽的數量總和設計。

擦拭方法：一般采用的擦拭方法如下圖所示：

舉例：A是由原料A和輔料Ⅰ制成的滅菌水溶液，在清潔驗證的分析方法開發過程中，將限度濃度的對照品溶液涂布在10×10cm的不銹鋼板后，方法開發的考察項目如下：

1.擦拭溶劑：擦拭溶劑先后采用水、乙醇、堿液，結果在應用水和乙醇時，回收率低于50%，應用一定濃度的堿液之后回收率可達到80%以上。

2.擦拭棉簽的數量和浸潤體積：2根棉簽的回收率為36.3%，4根棉簽的回收率為86.4%，5根棉簽的回收率為85.9%。

3.進樣分析前的供試品制備方法：擦拭棉簽加入定量的提取溶劑超聲，超聲5min的回收率為46.7%，超聲8min的回收率為86.2%，超聲10min的回收率為86.9%；超聲12min的回收率為85.5%。

綜上考察：確認擦拭溶劑選擇堿液，4根棉簽進行擦拭試驗，加入提取溶劑后超聲10min。

需要注意的幾點：①供試品進樣分析前供試品的制備需要考慮進行樣品中和；②棉簽的浸潤體積，需要根據棉簽的實際選擇適量體積的浸潤溶劑；

四淋洗回收率的考察

首先，需要確認的先決條件包括：

清潔溶劑：需確認產品的溶解性，在水中的溶解性和酸或堿中的溶解性。

稀釋溶劑：根據淋洗溶劑和待清潔產品的性質選擇合適的稀釋溶劑，如果淋洗溶劑為酸或堿溶液，需要進行適當的中和后，進行稀釋。稀釋溶劑避免與待清潔成分發生反應影響樣品的檢測。

舉例：C是由原料C和輔料Ⅰ制成的滅菌水溶液，在清潔驗證的分析方法開發過程中，方法開發的考察項目如下：

1.進樣前供試品的制備方法：直接用水為稀釋劑制備供試品回收率僅為45.8%；更換稀釋劑為X后供試品的回收率穩定在90%以上；分別考察了兩種不同稀釋劑的24小時內的供試品溶液穩定性，水為稀釋劑的RSD為20.7%，稀釋劑X的RSD為0.8%；

綜上考察，淋洗回收率中需要關注供試品的制備方法，稀釋劑的選擇必須結合待測產品的性質合理篩選，進而提高方法的回收率。

3.方法驗證內容

一驗證的項目

專屬性、定量限與檢測限、線性與范圍、精密度、準確度、溶液穩定性

二可接受標準討論

專屬性：要求空白、空白棉簽溶液均不干擾測定結果、擦拭和淋洗的供試品溶液的主峰的測定均不受干擾；

定量限與檢測限：按照S/N不小于10和3的要求進行判定，但是同時需要考察方法的定量限和檢測限；

線性與范圍：要求線性的相關系數不低于0.999，范圍包括定量限至擦拭或淋洗限度較大者的200%；

精密度與準確度：可根據待測組分的含量范圍按照Chp2020版的附錄中要求；

綜上所述，清潔分析方法的開發與驗證是產品共線生產的前提，一般在開展中試試制之前需要進行本項研發工作，但是清潔分析方法開發的一般思路卻又和含量測定方法略有差異，因此，本文結合了實際的案例對清潔分析方法開發的一般思路進行了適當的解析，希望可以與廣大同行一起學習和探討。