關(guān)鍵環(huán)節(jié)

與目標(biāo)成分相關(guān)的注意事項 

當(dāng)著手開始實驗方案設(shè)計時，研究者需要考慮許多問題以明確實驗的確切需求。

表一. 待測成分

需要檢測哪些成分和參數(shù)？

開始時便需要絕對清楚要研究的成分以及將要檢測該成分的何種特性。這聽起來理所當(dāng)然，但卻是首要的問題，并且是所有后續(xù)實驗活動的基礎(chǔ)。比如，研究者是希望檢測細(xì)胞裂解產(chǎn)物中特定蛋白的總量亦或只是磷酸化形式，還是需要兩者兼顧 [6, 7] ? 研究可能需要檢測特定的亞型或目標(biāo)蛋白不同的剪接體 [8, 9] 。就一種蛋白質(zhì)而言，要明確待測參數(shù)是蛋白含量還是蛋白的生物學(xué)功能，如酶活性或是一種細(xì)胞因子對潛在細(xì)胞靶點的影響。或許mRNA水平檢測基因表達(dá)的情況也滿足要求。研究也可能需要設(shè)計不同的實驗以分別檢測基因表達(dá)，穩(wěn)態(tài)蛋白質(zhì)的水平以及生物學(xué)功能 [7, 10, 11] ; 每一種實驗都會提供關(guān)于目標(biāo)分子不同但互補的信息。

成分的來源 

考慮待測成分的來源很重要。待測成分存在于體液如血清或尿液中？待測成分存在于實驗動物的某一器官中？或是存在于病人的活組織樣本中？或許來源材料是尸體的組織。當(dāng)然來源也可能是體外培養(yǎng)的細(xì)胞，在這種情況下一個重要的事項是這些細(xì)胞是稀少的原代細(xì)胞還是數(shù)量可控的永生細(xì)胞系。 

成分來源將限定樣品的數(shù)量和可用性。這也會限定目標(biāo)成分的濃度并嚴(yán)重影響到分子的穩(wěn)定性，這些將在后續(xù)的章節(jié)里討論。因此，目標(biāo)成分的來源很可能對最終確定的整個檢測流程產(chǎn)生深刻影響。

穩(wěn)定性 

了解待測成分的穩(wěn)定性是很重要的。它相對穩(wěn)定？還是非常不穩(wěn)定， 因此需要在收集和制備檢測所需的樣本過程中進(jìn)行特殊處理以獲取有意義的實驗數(shù)據(jù)？哪怕在分離狀態(tài)中穩(wěn)定的分子也可能因處于待測樣品復(fù)雜的生物學(xué)環(huán)境中而變得不穩(wěn)定：它們可能氧化，蛋白質(zhì)水解或是翻譯后修飾丟失的影響。因此有必要在樣品緩沖液中加入如還原性試劑或蛋白酶和／或磷酸酶抑制劑以保證待測成分在樣品處理和實驗檢測過程中都處在生理狀態(tài) [12] 。此處成分來源是一個重要的注意事項；在血清中穩(wěn)定的一種成分可能在肝臟勻漿液中會變得相當(dāng)不穩(wěn)定。如果采用活組織樣本或是尸體組織進(jìn)行實驗，了解組織的處理和存放方式很重要，因為這會對某些成分的數(shù)量和質(zhì)量有重大影響。

定量與半定量 

為設(shè)計出滿足要求的檢測方法，很重要的一點是在開始階段就要了解對分子進(jìn)行半定量檢測如蛋白印跡是否能滿足課題的要求，還是需要更為嚴(yán)格的定量方法。

待測樣品的數(shù)目 

另一個重要的注意事項是有多少樣品需要檢測。如果只是少量樣品需要檢測，那耗力多步驟的人工方法是完全可以接受的。相反，如果是成千上萬的樣品有待檢測，或許是化合物分析的一部分，那盡實驗室所能以簡化，流水線化并自動化整個試驗流程將變得很重要。對與待測成分相關(guān)的所有這些問題的解答非常關(guān)鍵，這將有助于研究者確定滿足他們特定要求的最合適的方案，并且應(yīng)當(dāng)在考慮下一章節(jié)討論的實驗原理時牢記在心。

檢測的基本原理

在考慮了有關(guān)將被檢測分子的這些問題之后，必須仔細(xì)注意一些不管是應(yīng)用在感興趣的特殊分子或者是被采用的特定的檢測格式上的基本技術(shù)／實際問題。

表二. 檢測基本原理

特異性 

一個絕對關(guān)鍵的考慮因素是該檢測法的特異性。在完全明確了需測量分子以及分子的參數(shù)之后，研究者需要建立一個將只測量他們想要測量的而沒有其他的檢測方法。如果這種檢測法同時測量所需分子和其他分子，可能需要采取手段去提高檢測的特異性。 

需要考慮兩個相關(guān)聯(lián)的檢測特異性的問題。

首先，主要的檢測試劑是否有相應(yīng)的特定性？例如，在基于高效液相色譜檢測法的情況下，一個研究員是該有多么自信才會認(rèn)定一個出現(xiàn)在特別停留時間上的峰是他感興趣的分子而不是另一個只是碰巧與感興趣分子共提出來的分子。這里需要考慮分析物的來源。尿液樣本的分析可能不會引起因為和感興趣分子共洗脫而出現(xiàn)的峰。然而，用相同檢測手段分析血清或組織勻漿樣品可能未必真實了。在基于抗體的檢測中，問題是，所采用的抗體是否對靶蛋白有絕對特異或者它也能與其他蛋白交互反應(yīng)？有可能所得的抗體是特異于某種特定蛋白或者某種特定的翻譯后修飾，例如特定位點的磷酸化作用或者基于蛋白酶而裂解產(chǎn)生的新抗原 [10, 11] 。

這類抗體試劑必須根據(jù)實際檢測條件嚴(yán)格定性以確保它們有所需的特異性，只與所需的產(chǎn)物而不是與基質(zhì)／前提分子起反應(yīng)。在不使用抗體檢測的實驗中，例如熒光多肽裂解實驗，特異性程度會降低很多。取代在特定位點裂解以產(chǎn)生信號，如今在多肽內(nèi)任何位點裂解也會產(chǎn)生信號。這產(chǎn)生了有關(guān)檢測特異性的第二個方面，即為一個在體外酶檢測的具體問題。即使檢測試劑在想要檢測的某一特定項目中有特異性，很可能在初始細(xì)胞裂解物或者組織勻漿中，多種酶能產(chǎn)生相同的效果（例如磷酸化作用，蛋白水解或者其他翻譯后修飾）。這個問題甚至?xí)壬厦媪谐龅臒晒怆牧呀鉁y試?yán)痈怀觥３跏剂呀馕镏械亩嘀刂貜?fù)活性這一問題常常能通過列入一額外的樣品處理步驟被克服，例如特定的免疫沉淀，以達(dá)到所要求的檢測特異性 [12] 。此外，根據(jù)研究的性質(zhì)，最好的解決方案可能是運用使用高純度（天然或重組）酶的活性檢測。

靈敏度 

檢測需要有多高的靈敏度？這將取決于樣品中所感興趣分子的水平和可得的樣品量。重要的一點是，檢測方法必須足夠靈敏，如此才能使待測組分的水平與檢測方法的動態(tài)區(qū)間很好的吻合（見下文）。在決定測驗版式和檢測系統(tǒng)時，這是一項重要的考慮因素。如果相比較吸光度，要求更高的熒光性靈敏度，讀數(shù)更可能要給出所需的靈敏度。通過利用酶原始信號的擴增，也能提升靈敏度 [13, 14] 。這種“耦合”的檢測系統(tǒng)可以非常敏感，但同時也會提升檢測樣品干擾試驗的幾率（見下文）。

動態(tài)區(qū)間 

確定檢測的動態(tài)區(qū)間很重要。換句話說，檢測讀數(shù)范圍與樣品中被分析的靶向分子的數(shù)量成正比。在一個測量分子濃度的實驗中，如圖1這個假設(shè)的例子，檢測過程（無論采用什么版式）通過構(gòu)建一個合適的校準(zhǔn)曲線進(jìn)行適當(dāng)校準(zhǔn)是重要的。同樣地，在一個酶試驗中，必須確保試驗在一個區(qū)間中進(jìn)行，如此才能測定最初的反應(yīng)比率，使得測定比率與加入檢測的酶總量成正比。為了在檢測的動態(tài)區(qū)間內(nèi)，樣品可能需要被稀釋或者濃縮。如果待測分子在不同樣品中的水平非常不同可能會是一個很特殊的問題。不能落在檢測的動態(tài)區(qū)間內(nèi)會導(dǎo)致產(chǎn)生假陽性數(shù)據(jù)。

干擾檢測讀值的因素 

設(shè)計檢測方法時，考慮哪些可能干擾讀值從而導(dǎo)致錯誤結(jié)果的因素非常重要。檢測方法的特異性已在上文討論。此處我們將討論其它可能干擾檢測讀值的因素。

圖 1. 檢測校準(zhǔn)/動態(tài)區(qū)間

在熒光讀值實驗中，保證待測樣品不會使熒光淬滅是很重要的。這可能是使用粗提的細(xì)胞裂解液或是組織勻漿進(jìn)行檢測時會遇到的特定問題。類似的，在用于化合物篩選或分析的熒光酶活或是細(xì)胞檢測中，研究者需要盡可能的保證檢測化合物不會使熒光讀值淬滅。這些化合物會表現(xiàn)出表觀抑制活性然而實際上它們對目標(biāo)靶點沒有直接的抑制效果。某些化合物本身便有熒光因此會導(dǎo)致錯誤的檢測信號。這類化合物干擾可利用在稍長波長激發(fā)的熒光報告子加以降低 [15]. 另一個普遍的問題是樣品組分的干擾如還原性試劑或去垢劑對某些常用的 蛋白檢測方法的干擾。

在酶耦聯(lián)的檢測中（酶活或是代謝產(chǎn)物檢測），確保耦聯(lián)酶不會檢測除了樣品中目標(biāo)成分之外的組分是非常關(guān)鍵的。如果這些檢測手段被用于化合物篩選或分析，那重要的一點是確保這些檢測方法得到合理配置因此它們只檢測對目標(biāo)酶的抑制而不是對耦聯(lián)酶的抑制。如果檢測樣品的組分可能會有明顯的干擾，研究者須要對特定步驟如（免疫）沉淀或部分純化進(jìn)行仔細(xì)考量以移除這些組分 [16] 。關(guān)鍵點是無論采取何種檢測手段，都要對潛在的干擾源提高警惕并設(shè)法清除或最小化它們可能帶來的影響。

重復(fù)性／穩(wěn)定性／準(zhǔn)確性 

為獲得可靠可用的數(shù)據(jù)檢測方法必須穩(wěn)定并可重復(fù)。檢測方法應(yīng)當(dāng)具有穩(wěn)定性，它不能受到樣品制備和處理過程中變化的過度影響。同樣的，不同個體進(jìn)行操作時它也應(yīng)當(dāng)能給出相同的結(jié)果。檢測方法也應(yīng)當(dāng)具備高重復(fù)性（也稱為準(zhǔn)確性），以保證實驗內(nèi)和實驗之間變異程度都盡可能小。在單次的檢測中，標(biāo)準(zhǔn)品和真實樣品的重復(fù)檢測應(yīng)當(dāng)給出非常接近的讀值。類似的，檢測讀值間因操作日期帶來的差異也應(yīng)當(dāng)很小。

如果檢測方法是為了測定特定成分的絕對含量（非相對含量），它應(yīng)當(dāng)以公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行校準(zhǔn)（見上文）以便給出準(zhǔn)確的定量。滿足要求的穩(wěn)定性，可重復(fù)性和準(zhǔn)確性依賴于檢測的目的，因此必須由研究者根據(jù)自己的特定目標(biāo)進(jìn)行調(diào)整。

檢測方法效果的統(tǒng)計學(xué)分析 

假設(shè)符合高斯分布，兩組結(jié)果之間的差值如果大于2SD（標(biāo)準(zhǔn)差）就被認(rèn)為在95%的置信區(qū)間上存在顯著性差異。類似的兩組結(jié)果之間的差值如果大于3SD（標(biāo)準(zhǔn)差）就被認(rèn)為在99.7%的置信區(qū)間上存在顯著性差異。因此，檢測方法的重復(fù)性（精度）越高，也就是說實驗讀值的SD越低，檢測方法的區(qū)分度將越高。

圖 2. 檢測方法效果評估。

檢測方法的效果可通過多種不同的方式進(jìn)行分析。

信號背景比或是信號窗口（S/B=平均信號/平均背景）和信噪比（S/N=平均信號-平均背景/背景的SD值）常被用來分析檢測方法的效果。然而，這些比值無法充分考量檢測方法的變化性。一個簡單的統(tǒng)計檢驗，Z’值被開發(fā)出來通過同時考量信號窗口和檢測變化性以檢驗檢測方法的質(zhì)量。Z'值越高（圖2），檢測方法的區(qū)分度越高，完美的檢測方法的Z’值為1.通常高通量檢測方法的Z’值只要>0.5便可。盡管Z'值檢驗源自對HTS檢測方法的評估，它已成為檢測方法質(zhì)量評估的通用標(biāo)準(zhǔn)并可適用于各種檢測方法 [17] 。

無標(biāo)記檢測和藥物發(fā)現(xiàn)／化合物分析

在藥物發(fā)現(xiàn)研究中頻繁使用以自動的方式進(jìn)行的高通量測定的熒光和發(fā)光標(biāo)記檢測方法。然而，隨著新技術(shù)的發(fā)展，對使用無標(biāo)記的利用生物物理檢測方法有越來越多的興趣 [18-20] 。現(xiàn)在市場上有許多無標(biāo)記檢測儀器 [18, 19] 。重要的是，無標(biāo)記測定法避免報告系統(tǒng)所造成的假象。例如，通常使用的生物發(fā)光性報告分子螢火蟲螢光素本身是GPR35的部分激動劑 [21] ， 因此潛在地復(fù)雜化了化合物／藥理數(shù)據(jù)的解釋。無標(biāo)記檢測一個額外的好處是，它們允許在疾病相關(guān)的主要針對受體的內(nèi)源性表達(dá)水平的原細(xì)胞和干細(xì)胞進(jìn)行化合物的篩選 [20] 。 

意想不到的報道子-化合物相互作用也可能發(fā)生在生物化學(xué)測定（除了以上討論的淬火和自發(fā)熒光的問題）。例如，好幾個當(dāng)用TAMRA標(biāo)記的肽底物顯示活化SIRT1的蛋白脫乙酰酶活性的化合物在用未標(biāo)記的版本相同的肽的天然全長蛋白底物酶測定中并無活性。用TAMRA標(biāo)記的底物所觀察到的活化是一種假象，是由于與TAMRA熒光團(tuán)的化合物的直接的物理相互作用 [22] 。

因此，在設(shè)計和驗證用于篩選／化合物分析的目的時，必須考慮化合物和報道子-相互作用的可能性是非常重要的。應(yīng)慎重考慮使用無標(biāo)記檢測在篩選時的一些的潛在利益。

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23. 來邦網(wǎng)