人源化單克隆抗體目前在腫瘤、自身免疫病、抗病毒等多個治療領域發揮著越來越重要的作用。截止目前，FDA已有50多種人源化抗體藥物獲批上市，人源化抗體為人類疾病的治療提供了廣闊的思路。抗體人源化技術包括嵌合抗體技術、人源化抗體技術和全人源抗體技術，并隨之衍生出單鏈抗體、雙特異性抗體、納米抗體等多種形式的小分子人源化單克隆抗體。本文對人源化單克隆抗體技術及人源化抗體的發展形勢作一綜述。

最早的單克隆抗體（簡稱單抗）是1975年Milstein和Kohler發明的鼠源單抗［1］，雖然其具有廣闊的應用前景，但由于恒定區可被人體免疫系統識別而產生免疫副反應，誘發人抗鼠抗體反應（human anti-mouse antibody reaction，HAMA）［2］，鼠源單抗的應用有諸多限制，目前主要應用于診斷領域。近年來，抗體技術的研究方向逐漸向人源方向發展［3］，迄今全球已上市的治療性抗體藥物有130多種，在抗腫瘤、抗病毒等多個領域發揮巨大作用［4］。抗體技術經40多年的發展，目前已有人鼠嵌合抗體、人源化抗體及全人源單抗等［5-6］，兔源及駝源抗體也逐漸應用于治療領域，同時也出現了不同于原始抗體結構的抗體，如單鏈抗體、雙特異性抗體、納米抗體等，它們在傳統抗體的結構上進行改進，使抗體的應用更具有靶向性、功能性和操作性，能夠實現很多傳統抗體所不能實現的功能。本文對近年來單抗人源化技術及其發展形勢作一綜述。

1 單抗人源化技術

1. 1 人鼠嵌合抗體（chimeric antibody）技術

人鼠嵌合抗體是抗體人源化進程中最早研究的抗體，是一種基因工程表達的重組抗體［7］，通過將鼠源抗體可變區基因與人源抗體恒定區基因融合表達，使其人源序列占整個抗體的70%左右，大大降低了抗體的HAMA［8］。由于不同亞型的IgG恒定區與補體和Fc受體的作用能力不盡相同，篩選得到的抗體恒定區可產生抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用補體依賴性的細胞毒作用（complement dependent cytotoxicity，CDC）等多種功能［9］，目前應用最多的為IgG形式的嵌合抗體。最早上市的人鼠嵌合抗體是Reopro，之后還有Sylant、Rituximab［10］、Infliximab等成功上市。

由于人鼠嵌合抗體所保留的鼠源序列較多，在進行臨床實驗時仍會被人體的免疫系統所識別產生HAMA發生，同時，由于其免疫位點的改變，致使抗體的活性降低，在實際應用中往往需多次免疫才能達到預期效果［11］。

1. 2 人源化抗體技術

人源化抗體技術以人鼠嵌合抗體為基礎繼續進行改造，鼠源序列進一步減少，從而減少HAMA的發生［12］。抗體的可變區包含3個互補決定區（complementary determining region，CDR）和4個框架區（framework region，FR），人源化抗體通過抗體重構、框架區重構等技術來達到減少鼠源序列的目的。目前上市的人源化抗體有Trastuzumab、Bevacizumab、Ranibizumab、Aletuzumab等。

1.2.1 抗體重構

抗體重構也稱為CDR移植，與嵌合抗體不同的是，抗體重構是將人源的FR序列克隆至抗體的相應部位，僅保留了鼠源的CDR序列。重構抗體的人源化程度可達90%以上，目前該方法是單抗人源化過程中最常用的方法［13］。由于重構抗體移植區域明顯少于人鼠嵌合抗體，該抗體中異源序列的含量進一步減少，免疫原性顯著降低，臨床療效良好。但抗體重構在實際應用中仍存在潛在的免疫原性，因此，CDR移植的發展方向是減少不必要的CDR的引入。

1.2.2 特異性決定殘基（specificity determining residue，SDR）移植

隨著研究的深入，人們發現CDR區并非所有的氨基酸序列均具有免疫原性，CDR區的某些特定的氨基酸殘基可與抗原接觸，從而識別特定抗原，但還有其他氨基酸序列未參與該過程，這些與抗原接觸的氨基酸序列被稱為SDR。在構建重組抗體的過程中，只需將SDR克隆至抗體的框架中，即可獲得目標抗體，從而進一步降低鼠源序列［14］。

1.2.3 框架區重構

在CDR移植過程中，對FR進行的篩選選擇與鼠源抗體序列最相似的人FR基因序列使該抗體具有更高的活性［15］。FR的修飾包括表面重塑與糖基化修飾兩方面：表面重塑即將鼠源抗體FR表面氨基酸殘基進行人源化，而這些氨基酸殘基在免疫應答中并不能起到重要作用；糖基化修飾即改變原有的糖基化位點，從而使抗體的作用效力更高。框架區重構可得到親和活性明顯提升的抗體，是重構抗體中經常用到的手段［16］。

1. 3 全人源抗體技術

人源化單抗仍具有潛在的免疫原性，而且各種氨基酸的替換需要大量的實驗，而全人源抗體的氨基酸序列均由人源抗體基因序列編碼，理論上可達到100%的人源化［17］，見圖1。目前應用最多的全人源抗體技術有轉基因鼠技術和抗體庫技術［18］。目前已上市的全人源抗體有Nivoluma、Pembrolizumab、Denosumab等。

1.3.1 轉基因鼠技術

1994年，美國首先利用轉基因小鼠生產人源化單抗。轉基因小鼠技術將優化的編碼人抗體DNA序列導入至免疫缺陷小鼠的基因組中［19］，由于缺乏鼠源性免疫球蛋白基因，在抗原免疫后，小鼠分泌的抗體均由人抗體的DNA序列編碼，同時產生的抗體也不會被小鼠的免疫系統識別并產生其抗體［20-21］。由于該抗體是在體內產生，經歷了正常的抗體裝配和成熟，從而保證了產生的抗體具有很高的靶結合能力。已上市的Nivolumab、Denosumab、Panitumumab 等均是由轉基因小鼠生產的。但比較顯示，轉基因動物產生的全人源單抗并沒有野生型抗體產生的作用明顯，另外，由于轉基因小鼠免疫系統仍為小鼠本身的系統，不能產生和人體完全相同的抗體。

1.3.2 抗體庫技術

抗體庫技術首先需建立抗體庫，目前有免疫抗體庫和非免疫抗體庫兩種［22］。免疫抗體庫的建立首先要通過疫苗注射等途徑進行免疫，再從體內采集抗體，通過單細胞克隆技術等建立抗體庫［23-24］。非免疫抗體庫有半合成抗體庫、全合成抗體庫和天然抗體庫3種：半合成抗體庫是合成隨機的CDR序列；全合成抗體庫則是整個可變區完全由人工合成；天然抗體庫的抗體基因來源于未免疫個體的淋巴細胞，由于未用特異性抗原免疫，可用于多種抗原的篩選，但所得抗體由于未經抗體親和力成熟等過程，親和力較低［25］。

1.3.2.1 噬菌體展示技術（phage dispay）

噬菌體展示技術將抗體庫中可變區基因在噬菌體表面表達，經抗原抗體結合后，篩選出親和力最高的抗體，從而用于制備人源化單抗產品［26］。由于該方法是在體外篩選，更易于自動化與高通量化。體外篩選還克服了免疫耐受性，能夠篩選出識別高度保守靶點的蛋白。Necitumumab及Adalimumab等均是由噬菌體庫篩選的［27］。但庫容量的限制、宿主對氨基酸修飾的限制、細胞毒蛋白的限制等仍會影響目的蛋白質的表達。

1.3.2.2 核糖體展示技術（ribosome display）

與噬菌體展示技術不同的是，核糖體展示技術所產生的抗體不會存在于噬菌體表面，而是直接在非細胞培養系統中表達。該技術首先需利用PCR擴增目的基因DNA文庫，再導入一系列轉錄元件進行體外轉錄，在無細胞翻譯系統中進行翻譯，使靶基因的翻譯產物展示在核糖體表面，形成mRNA-蛋白質-核糖體三元復合體，再向翻譯混合物中加入抗原進行篩選，以獲得親和力最高的蛋白質。核糖體展示技術作為一種無細胞展示系統，經20多年的發展，已成功應用于體外篩選特異性結合抗體［28］。與噬菌體展示技術相比，核糖體展示技術解決了噬菌體展示技術的抗體庫容量問題，可表達包含毒性蛋白在內的所有蛋白質，實現了更高庫容量的表達。

1.3.2.3 mRNA 展示（mRNA display）技術

mRNA展示技術的原理與核糖體展示技術基本相似，不同的是，mRNA展示系統翻譯出來的蛋白是與mRNA通過接頭連接在一起的，由于無核糖體的存在，更有利于篩選，而核糖體展示由于mRNA、多肽和核糖體三位一體，可能會影響接下來的篩選，丟失部分抗體，同時，由于其結合的不穩定性，很有可能導致篩選失敗［29］，因此，mRNA展示技術是核糖體展示技術的改良與延伸。

1.3.2.4 酵母展示技術（yeast display）

酵母展示技術利用酵母作為載體，將外源基因通過融合表達的形式定位至酵母細胞表面，從而展現出最完整的蛋白結構以進行篩選。酵母作為一種真核生物，既能實現蛋白表達過程中的翻譯后修飾過程，又能將蛋白的表位完全呈現出來，還可通過熒光素等標志物標記酵母細胞，繼而利用流式細胞術進行實時和定量篩選。

1.3.2.5 單細胞技術

隨著基因測序技術及流式細胞術的發展，近年來單細胞技術研究火熱，在人源化抗體領域應用廣泛。該技術可從建立好的抗體庫內根據細胞表面標記分子篩選出單個細胞，細胞富集后利用RT-PCR直接獲得抗體的重鏈和輕鏈基因［30］。免疫過疫苗的人外周血抗體庫篩選出來的高特異性抗體可用來制備全人源抗體，免疫過疫苗的兔脾臟可用來篩選兔源單抗，經抗體人源化后即可應用于人體，Brolucizumab為全球首個獲批的兔源單抗［31］。

綜上所述，抗體庫技術徹底改變了單抗的制備方法，擺脫了對鼠源細胞的依賴，產生的抗體完全人源化，是當下研究的熱點。

2 新型抗體

隨著抗體技術的發展，抗體的結構也不僅局限于最原始的結構，逐漸發展出單鏈抗體、雙特異性抗體、納米抗體以及以DNA編碼的單抗等。目前已有多種不同類型的人源化單抗上市。

2. 1 單鏈抗體（single-chain Fv）

單鏈抗體由于不含抗體恒定區，其相對分子質量要小于正常的抗體，同時也失去了與Fc 受體結合的功能，但也因此，其可塑性非常強，可與多種分子結合，從而介導不同的殺傷作用，如制備靶向作用的“生物炮彈”、抗體融合蛋白［32］、抗體-藥物偶聯物（antibody-drug conjugate，ADC）［33］等，同時，由于其相對分子質量小，產生HAMA的幾率非常低［34］，已上市的單鏈抗體有Bren-tuximab vedotin 和Ado-trastuzumabemtansine等。單鏈抗體人源化的技術有多種，以噬菌體展示和核糖體展示技術最為常用，鼠源抗體經蛋白質測序后進行CDRs移植的方法也有文獻報道［35］。但單鏈抗體也存在抗原性弱、效果不穩定的缺點，在實際應用中往往存在諸多限制。

2. 2 雙特異性抗體（bispecific antibody）

雙特異性抗體的可變區含有兩種不同抗原的結合位點［36-37］，這兩種結合位點可以是分別與效應細胞和腫瘤細胞結合的，從而激發出具有導向性的免疫反應［38-39］，也可以是靶向兩種腫瘤位點的，以減少用藥量以及臨床審批的步驟，也會起到更強的免疫作用。目前雙特異性抗體制備最常規的手段是基因工程方法，也可利用兩種雜交瘤細胞融合、化學偶聯法等方法制備［40］，現已成為抗體工程領域研究的熱點，在腫瘤治療及抗病毒領域應用廣泛［41］。同時靶向CD19和CD3的Blinatumomab以及治療血友病的Emicizumab均為該類抗體藥物［42］。

2. 3 納米抗體（nanobody）

納米抗體是1993年最早從羊駝體內發現的抗體，其天然缺失輕鏈和CH1恒定區。由于其相對分子質量小，體內組織滲透性好，可很輕易地穿過血管到達靶標。天然的羊駝納米抗體與人源抗體相比，其氨基酸殘基差別并不大。目前已有利用噬菌體展示技術以及轉基因小鼠技術制備全人源化納米抗體的報道。針對von Willebrand因子的Caplacizumab-Yhdp作為全球首個獲批的納米抗體藥物，為納米單抗藥物的研發提供了廣闊的前景。由于目前上市的產品較少，未來納米抗體的長期使用是否會產生免疫副反應仍需觀察。

2. 4 DNA 編碼的單抗（DNA-encoded monoclonal antibody，dMAb）

DNA編碼的單抗是新興起的一種全人源單抗技術。與當前常規治療性抗體不同，其是在人體內產生，而并非在體外合成。與DNA疫苗類似，dMAb首先需構建出一種序列優化的質粒，用于編碼一種單抗，借助CELLECTRA誖等公司的電穿孔技術將重組質粒轉至人體內，使該單抗基因在人體中表達。dMAb可進行序列優化，從而使抗體在體內表達量顯著提升，刺激強大的CD8+T細胞浸潤，同時還能保持以往的抗原抗體結合能力。dMAb技術應用非常廣泛，當前現有的人源化單抗均可由基因編碼后在人體內表達，是一種抗體全人源化的全新手段。dMAb技術由于興起較晚，目前還處于研發階段，暫時無上市的單抗［43］。

3 國內外抗體藥物發展趨勢

目前國外人源化單抗的生產以創新為主，全球已有80多種單抗類藥物獲批上市，其中美國食品藥品監督管理局已批準50多種。截至2019年5月，國內共批準單抗藥品36個，其中國產14個，進口22個，與美國差距明顯。隨著多種原研單抗藥物的專利到期，近年來國外生物類似藥獲批數量也逐漸增多，呈井噴式發展。截止目前，歐盟已有17種單抗類生物類似藥獲批上市，美國已有10種。最早獲批上市的生物類似藥是歐盟2013年批準的英夫利西單抗，2016年，美國安進公司（Amgen）阿達木單抗的生物類似藥AMJEVITA在美國食品藥品監督管理局獲批上市，這也是阿達木單抗首個獲批的抗體生物類似藥。國內人源化單抗由于起步較晚，研發水平與發達國家存在較大差距，目前以進口藥為主，但自研藥以及生物類似藥的研究也發展迅速。2015年2月，國家食品藥品監督管理總局正式頒布《生物類似藥研發與評價技術指導原則》（試行），規范了生物類似藥的申報程序、注冊類別和申報資料等相關注冊要求，為生物類似藥的研發提供了基本指導和依據。在政府的大力支持及行業和市場的合力驅動下，國內的生物類似藥研究呈指數上升趨勢，靶點主要集中在CD20、EFGR、VEGF、TNF和HER2，包括阿達木單抗、貝伐單抗、曲妥珠單抗、利妥昔單抗及英夫利昔單抗等在內的多種專利已過期或即將過期的原研單抗藥物成為國內藥企爭先研發的熱點。2019年2月，由上海復宏漢霖生物技術股份有限公司研發的首個國產利妥昔單抗生物類似藥漢利康誖上市，意味著在生物類似藥開發領域，我國生物醫藥產業已處在從“跟跑歐美”轉向“與歐美并跑”的關鍵節點。

4 展望

近年來，在全球批準的新藥中，人源單抗類藥物所占比例越來越大，可見人源單抗具有很高的應用價值，為腫瘤、自身免疫性疾病等多種疾病的治療提供了新的思路。雖然抗體人源化后理論上能降低HAMA，但目前尚無法完全消除，越來越多的報道顯示，人源化抗體在應用過程中仍可產生HAMA［44］，因此，合理運用上述方法和技術創新，在原有的基礎上減少抗體異源性，不斷提高抗體的親和力，開發出針對全新靶點的人源抗體，是抗體藥物發展的必由之路，必將為新藥開發開辟新的道路。另一方面，隨著生物類似藥的逐漸上市，未來以外企為主的競爭格局將逐漸被打破，鑒于生物類似藥較原研藥具有明顯的價格優勢，加上國家醫保政策的強力支持，生物類似藥將更好、更廣泛地惠及患者，對醫療大健康產業持續性地產生積極影響。