核苷酸具有提高人體免疫力、促使細(xì)胞再生與修復(fù)等生理功能，對(duì)人體生長(zhǎng)發(fā)育有一定促進(jìn)作用。核苷酸包括嘌呤和嘧啶兩類核苷酸化合物，它們?cè)诩?xì)胞中物質(zhì)生化合成、能量供給、DNA和RNA合成和必需輔酶產(chǎn)生等一般生理代謝中起著關(guān)鍵作用，它們具有不同能量消耗、能量保存與物質(zhì)補(bǔ)償途徑，嘌呤核苷酸主要從核苷堿基獲得補(bǔ)充，嘧啶核苷酸主要是從核苷獲得補(bǔ)償。由此可見，核苷酸被認(rèn)為是一類重要的功能食品有效因子成分，在膳食補(bǔ)劑食品奶粉中添加核苷酸及核苷成為國(guó)際共識(shí)。目前美國(guó)和歐盟規(guī)定嬰幼兒奶粉中5種核苷酸（CMP、UMP、GMP、IMP 、AMP）的含量標(biāo)準(zhǔn)，美國(guó)規(guī)定奶粉中核苷酸的含量上限為16mg/100 kcal,歐盟規(guī)定的含量上限為5mg/100 kcal。我國(guó)也在現(xiàn)行的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB14880-2012《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定了允許使用量為0.12-0.58g/kg（以核苷酸總量計(jì)）。

目前，我國(guó)已發(fā)布的核苷酸檢測(cè)方法為GB5413.40-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嬰幼兒食品和乳品中核苷酸的測(cè)定》，該標(biāo)準(zhǔn)采用高效液相色譜技術(shù)檢測(cè)核苷酸的分析方法，樣品基質(zhì)對(duì)液相色譜檢測(cè)干擾比較大，文獻(xiàn)報(bào)道也有一些檢測(cè)方法，如熒光法、高效毛細(xì)管電泳法、高效液相色譜法、離子色譜法、液相色譜-質(zhì)譜法等，除了質(zhì)譜方法，現(xiàn)有方法不太成熟，樣品處理過于復(fù)雜，各有缺陷。

本文研究利用高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的高靈敏度和抗干擾能力等特點(diǎn)，在一定程度上消除了機(jī)制干擾，且樣品前處理方式較為簡(jiǎn)單，可同時(shí)快速篩選和確證嬰幼兒配方奶粉中的5中核苷酸。通過實(shí)際樣品檢測(cè)，驗(yàn)證了該方法的有效性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器和試劑

高效液相色譜儀U-3000（賽默飛世爾科技ThermoFisher Scientific公司）；三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀TSQQUANTIVA，配ESI源（賽默飛世爾科技ThermoFisher Scientific公司）；KQ-700DE超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）

胞嘧啶核苷酸（CMP）、尿嘧啶核苷酸（UMP）、次黃嘌呤核苷酸（IMP）、鳥嘌呤核苷酸（GMP）、腺嘌呤核苷酸（AMP）標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)于Sigma公司；乙腈和甲酸（色譜純）購(gòu)于德國(guó)Merck公司；實(shí)驗(yàn)所用水為純水機(jī)（Milli-Qintegral 3）制備的超純水（電阻率18.2MΩ.cm）。

1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取經(jīng)純度折算后的適量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（精確到0.1mg），用超純水稀釋，難溶的標(biāo)準(zhǔn)品，加少量甲酸溶解，再用超純水定容至刻度，配制成濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。于4℃以下避光保存。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.5 mL于10 mL 容量瓶中，用超純水定容至刻度，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為50.0 mg/L。使用前用初始流動(dòng)相將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3樣品前處理

稱取1.0 g均勻樣品（精確至0.01 g），加30mL 水，振蕩、超聲至完全溶解，轉(zhuǎn)移50 mL容量瓶中，定容至刻度。取5mL 試樣于50 mL離心管，加入150µL 1%甲酸溶液，超純水定容至刻度線，置于超聲波清洗器中超聲波提取10 min后，在4℃下離心20 min (轉(zhuǎn)速10000 rpm)。吸取上清液，用0.22 μm有機(jī)濾膜的一次性濾頭過濾，待液相色譜-質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.4儀器條件

色譜柱：AgilentZORBAX SB-Aq，3.0*100mm（i.d.），1.8μm；流動(dòng)相：A,0.1%(v/v)甲酸水溶液；B，乙腈。梯度洗脫程序：0.0-4.0min，99%A；4.0-5.0min，10%A；5.1-7.0,99%A。流速：0.25mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣體積：10μL；分析時(shí)間：7 min。

質(zhì)譜條件：ESI源，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）正離子模式；電噴霧電壓：3200V；鞘氣：40 Arb；輔助器：8Arb；離子傳輸管溫度：350℃；碰撞氣：氦氣。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1五種核苷酸在MRM模式下檢測(cè)的質(zhì)譜參數(shù)

Table 1  MS/MS parameters for 5 nucleotides in MRM mode

*：定量離子對(duì)（quantitativeion）

2 結(jié)果和討論

2.1蛋白質(zhì)沉淀方法優(yōu)化

檢測(cè)乳粉中核苷酸含量的檢測(cè)方法主要考慮既能將樣品中蛋白質(zhì)分離出去，又能將核苷酸無損失的提取出來；通常都采用水提取核苷酸，蛋白質(zhì)的沉淀方法主要有乙酸、甲酸、高氯酸、三氯乙酸等酸沉淀法、乙酸鋅+亞鐵氰化鉀鹽沉淀法以及氯仿有機(jī)溶劑沉淀法。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)高氯酸沉淀方法核苷酸損失較大、氯仿沉淀法核苷酸回收率比較低，亞鐵氰化鉀可能存在重金屬離子對(duì)質(zhì)譜儀器的損耗，所以主要探討了乙酸、甲酸與三氯乙酸等3種有機(jī)酸沉淀方法，根據(jù)對(duì)上述樣品前處理方法的比較發(fā)現(xiàn)，甲酸沉淀蛋白方法色譜峰形最好。因此決定采用1%甲酸沉淀蛋白質(zhì)的樣品前處理方法。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在稱樣量為 1 g，用50mL水超聲溶解后，取5mL樣液，加入1%甲酸溶液沉淀蛋白質(zhì)，比較了  0.1 mL、0.12 mL、0.15 mL、0.25 mL、1 mL等五種甲酸用量核苷酸的回收率，結(jié)果表明，用0.12～0.15 mL甲酸溶液，可有效沉淀樣液中蛋白質(zhì)，所得回收率在80%以上，能滿足要求。

2.2液相條件的優(yōu)化

比較了實(shí)驗(yàn)室常用的幾根C18色譜柱，ZORBAXSB-Aq，3.0*100 mm（i.d.），1.8μm，Xbridge C₁₈ 100×2.1 mm（i.d），3.5μm，Kinetex XB-C₁₈ 100×2.1 mm（i.d），2.6μm， Atlantis T₃ 100×3.0 mm（i.d），3μm。結(jié)果表明ZORBAX SB-Aq，3.0*100mm（i.d.），1.8μm色譜柱分離效果比較好。同時(shí)，比較甲酸水溶液與乙腈、甲酸-甲酸銨水溶液與乙腈、甲酸水溶液和甲醇和甲酸-甲酸銨水溶液與甲醇等4種流動(dòng)相配比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.1%甲酸水溶液與乙腈體系，5種核苷酸目標(biāo)物在正負(fù)離子化模式均出峰，最終選擇液相流動(dòng)相條件為下表2：

表2 流動(dòng)相、流速及梯度洗脫條件

2.3質(zhì)譜測(cè)定條件的優(yōu)化

首先采用200 μg/L 的核苷酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在正離子模式下進(jìn)行母離子全掃描，確定分子離子，然后分別以分子離子為母離子，對(duì)其子離子進(jìn)行全掃描，選取豐度較強(qiáng)、干擾較小的兩對(duì)子離子為定性離子。最后以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）正離子模式優(yōu)化各種質(zhì)譜參數(shù)。圖1顯示了標(biāo)準(zhǔn)品分離情況和按照表1的質(zhì)譜參數(shù)采集的核苷酸定性分析結(jié)果。

圖1 核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品的MRM譜圖

Fig.1Chromatograms of nucleotide standards in MRM mode

2.4方法學(xué)考察

2.4.1 線性范圍

將五種核苷酸的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，依次配置為濃度均為25 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、400 mg/mL、800 ng/mL、1000 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別以各分析物的峰面積（Y）和對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度（X，ug/mL）進(jìn)行線性回歸計(jì)算，得到的線性方程的相關(guān)系數(shù)見表3。5種核苷酸在各自的線性范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（相關(guān)系數(shù)r>0.999）。

表3 5種核苷酸的線性方程與相關(guān)系數(shù)

Table 3 Regression eqations and correlation coefficientsof nucleotide

2.4.2 檢出限與定量限

取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液經(jīng)稀釋后測(cè)定，以信噪比（S/N）為10時(shí)對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為方法定量限，得到5種核苷酸的LOQ分別為CMP 0.4 mg/kg、AMP 0.5mg/kg、UMP3.4 mg/kg、GMP 5.0 mg/kg、IMP 2.6 mg/kg。

2.4.3 加標(biāo)回收率和精密度

取用陰性基質(zhì)的奶粉，分別添加3個(gè)水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液后，按照1.3中的步驟進(jìn)行除雜和凈化，加標(biāo)水平分別為2.0、5.0、10.0 mg/100g；每個(gè)水平平行測(cè)定6次以評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確度。該方法的平均加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）結(jié)果見表4。

表4 核苷酸的加標(biāo)回收率及精密度（n=6）

Table 4 Recoveries and relative standard deviations (n=6)

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了高效液相色譜-質(zhì)譜-質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)乳粉中5種核苷酸的檢測(cè)方法。樣品經(jīng)1%（v/v）甲酸溶液沉淀蛋白質(zhì)、脂肪等雜質(zhì)，高速離心后直接進(jìn)樣。本檢驗(yàn)方法前處理過程簡(jiǎn)便，靈敏度高，定量結(jié)果準(zhǔn)確，能夠滿足日常檢測(cè)需要。