[摘要] 作為一種新興的治療方法，寡核苷酸藥物（ONTs）在罕見病和某些慢性疾病領域展現出了良好的應用前景和開發潛力。目前，全球范圍內已有20種ONTs上市，主要包括反義寡核苷酸（ASO）、小干擾RNA（siRNA）和適配體（Aptamer）等，并有越來越多的ONTs進入臨床開發階段。業界已對ONTs的序列設計、化學修飾和遞送系統等積累了較多的經驗，但對于非臨床安全性評價尚缺乏系統認識，也尚未形成全球監管的一致要求。本文系統調研了ONTs的主要毒性來源及其影響因素，以及美國食品藥品監督管理局（FDA）已批準上市的ASO和siRNA藥物研究案例，在此基礎上闡述了ONTs非臨床安全性評價的研究內容、關注要點的一般考慮，以期為我國ONTs的研發提供參考。

[關鍵詞] 寡核苷酸藥物；非臨床；安全性評價；一般考慮

 

 寡核苷酸藥物（oligonucleotide therapeutics，ONTs）通常由20~60個核苷酸組成，主要包括反義寡核苷酸（antisense oligonucleotide，ASO）、小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）和適配體（Aptamer）等[1]。作為一種新興的治療手段，ONTs不僅在罕見病領域展現出良好的應用前景，在其他慢性疾病治療領域（如高血壓和高血脂等）也顯示出巨大的開發潛力[2,3]。截至2024年1月，全球范圍內已有20種ONTs獲批上市，并有越來越多的ONTs進入臨床開發階段[4]。近年來，ONTs在合成工藝方面取得的重大突破也為新的ONTs的研發創造了契機。業界已對ONTs的序列設計、化學修飾和遞送系統等積累了較多的經驗，但對于非臨床安全性評價尚缺乏系統認識，包括研究策略、研究內容和關注點等。

目前，國際上尚未形成統一的用于指導ONTs研發和評價的指導原則。僅日本藥品和醫療器械管理局（PMDA）于2020年3月發布了《ONTs的臨床前安全性評價指導原則》[5]（下文稱日本指導原則）。2024年11月，美國FDA發布了《Nonclinical Safety Assessment of Oligonucleotide-Based Therapeutics》草案，目前正在征求意見。國際人用藥品注冊技術協調會（The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use, ICH）也啟動了與該主題相關指導原則的起草工作。我國尚未發布相關指導原則。本文系統調研了ONTs的主要毒性來源及其影響因素，以及美國食品藥品監督管理局（FDA）已批準的ASO和siRNA藥物的研究案例，并對ONTs非臨床安全性評價的策略、研究內容和關注點進行了概述，以期為我國ONTs的研發提供參考。

 

1.ONTs主要毒性來源和影響因素

ONTs的主要毒性分為兩類，即基于Watson-Crick互補配對原則的雜交依賴型毒性和基于化學結構、理化性質和遞送載體的雜交非依賴型毒性[6]。雜交依賴型毒性又分為在靶毒性和脫靶毒性，前者由ONTs藥理學作用的放大引起，后者由ONTs與靶mRNA序列相似的轉錄本雜交而產生[7]。雜交非依賴型毒性不依賴于雜交，主要包括補體激活、血小板減少、凝血抑制、免疫刺激和高暴露器官的毒性反應[6,8,9]。

未經化學修飾的寡核苷酸易被廣泛存在于細胞外和細胞內環境中的核酸酶降解，與血漿蛋白結合的能力較弱，經腎小球濾過后可被迅速清除，導致其在血漿中的半衰期較短，不利于靶組織分布和藥效發揮[10,11]。研究表明，化學修飾如硫代磷酸酯（PS）、2'-O-甲氧基乙基（MOE）可提高寡核苷酸對核酸酶的抗性，增強與血漿蛋白的結合，延長在血漿中的半衰期[12]。因此，與未經修飾的寡核苷酸相比，修飾后的寡核苷酸具有更好的藥代動力學和組織分布特征，但也可能帶來新的毒性。

此外，給藥途徑和遞送載體也是影響ONTs毒性的重要因素。經脂質納米顆粒（Lipid Nanoparticle，LNP）遞送或N-乙酰氨基半乳糖（N-acetylgalactosamine, GalNAc）偶聯的siRNA能夠實現對肝臟等臟器的高效遞送，同時由于在這些組織中的暴露量較高、半衰期相對較長，導致聚集并引起相關毒性反應[13]。

 

2. 已上市ONTs安全性特征

2.1已上市ONTs基本信息概述

截至2024年1月，全球范圍內已經批準了20種ONTs上市（表1），其中ASO和siRNA占大多數，主要通過反義機制和適配體機制發揮藥理作用。

表1 已批準上市的ONTs基本信息匯總

通用名	商品名	上市時間	藥物類型	靶點	臨床適應癥	給藥途徑
Fomivirsen	Vitravene	1998	ASO	CMV	巨細胞病毒視網膜炎	ivt
Pegaptanib	Macugen	2004	Aptamer	VEGF	黃斑變性	ivt
Mipomersen	Kynamro	2013	ASO	ApoB	IIa型高脂蛋白血癥	sc
Eteplirsen	ExONTys 51	2016	ASO	Exon51	杜氏肌營養不良癥	iv
Nusinersen	Spinraza	2016	ASO	SMN2	脊髓性肌萎縮癥	itt
Defibrotide	Defitelio	2016	Oligonucleotide	PAI-1+tPA+ vWF	肝靜脈閉塞性疾病	iv
Inotersen	Tegsedi	2018	ASO	TTR	遺傳性轉甲狀腺素蛋白淀粉樣變性	sc
Patisiran	Onpattro	2018	siRNA	TTR	遺傳性轉甲狀腺素蛋白淀粉樣變性	iv
Volanesorsena	Waylivra	2019	ASO	ApoC3	I型高脂蛋白血癥	sc
Golodirsen	VyONTys 53	2019	ASO	Exon53	杜氏肌營養不良癥	iv
Givosiran	Givlaari	2019	siRNA	ALAS1	急性肝卟啉癥	sc
Viltolarsen	Viltepso	2020	ASO	Exon53	杜氏肌營養不良癥	iv
Inclisiran	Leqvio	2020	siRNA	PCSK9	原發性高膽固醇血癥或混合性血脂異常	sc
Casimersen	AmONTys 45	2021	ASO	Exon45	杜氏肌營養不良癥	iv
Lumasiran	Oxlumo	2021	siRNA	HAO1	原發性高草酸尿癥1型	sc
Vutrisiran	AMVUTTRA	2022	siRNA	TTR	遺傳性轉甲狀腺素蛋白淀粉樣變性	sc
Tofersen	QALSODY	2023	ASO	SOD1	肌萎縮性脊髓側索硬化癥（ALS）	itt
Avacincaptad  pegol	Izervay	2023	Aptamer	C5	地圖樣萎縮	ivt
Nedosiran	Rivfloza	2023	siRNA	LDH	原發性高尿酸血癥	sc
Eplontersen	Wainua	2023	ASO	TTR	遺傳性轉甲狀腺素蛋白淀粉樣變性	sc

 

注：“*”表示僅獲得EMA批準上市。ivt，玻璃體注射；itt，鞘內注射（intrathecal）。

 

CMV，巨細胞病毒；VEGF，血管內皮生長因子；ApoB，載脂蛋白B；Exon，外顯子；SMN2，運動神經元存活蛋白2；PAI-1，纖溶酶原激活物抑制劑-1；tPA，組織型纖溶酶原激活劑；vWF，血管性血友病因子；TTR，轉甲狀腺素蛋白；ApoC3，載脂蛋白C3；ALAS1，5'-氨基乙酰丙酸合酶1；PCSK9，前蛋白轉化酶枯草溶菌素9；HAO1，羥基酸氧化酶1；SOD1，超氧化物歧化酶1；C5，補體蛋白C5；LDH，乳酸脫氫酶。

 

2.2已上市ONTs非臨床和臨床安全性研究結果及相關性分析

根據FDA審評報告和說明書，本文對FDA已批準上市的ONTs非臨床毒性表現和臨床常見不良反應進行了匯總（見表2）。ONTs在非臨床研究中常見注射部位和高暴露器官的毒性反應，主要表現為注射部位反應、肝臟和腎臟嗜堿性顆粒聚集和空泡化等；并可見藥理學相關指標的改變。研究表明，嗜堿性顆粒聚集是寡核苷酸被遞送到高暴露器官后，分布到具有吞噬活性的細胞（如肝枯否細胞和腎臟近曲小管上皮細胞）中，經蘇木精染色后在顯微鏡下的表現[14]，免疫組化和電鏡觀察對該結果進行了確認[13]；各種大小的空泡與嗜堿性顆粒聚集通常發生在胞漿的同一區域，推測空泡的形成與溶酶體中局部高濃度的寡核苷酸引起的滲透不平衡所導致的膜結合的溶質聚集物膨脹有關[15]。

表２　已上市的部分ONTs非臨床毒性表現和臨床常見不良反應

臨床試驗中常見的不良反應包括注射部位反應、輸液相關反應、肝損傷和腎臟毒性等。通過比較這些ONTs的非臨床毒性表現和臨床常見不良反應發現，非臨床研究較好地預測了多數已批準ONTs出現的臨床不良反應。如經玻璃體注射（ivt）的Fomivirsen在非臨床和臨床研究中均可見眼部炎癥；Inotersen在動物和人體中均可見明顯的血小板減少；Nusinersen在非臨床研究中可見神經元病變，在臨床試驗出現頭痛等不良反應等。值得關注的是，由于非臨床安全性試驗中所采用的是健康動物且檢測手段有限，某些可能在患者中出現的不良反應較難通過動物模型進行預測，需要在臨床試驗中進一步評估。

綜上，ONTs的非臨床安全性評價包括對在靶毒性和脫靶毒性的考察，可以對臨床不良反應的可能性和風險程度進行預測。

 

3.      ONTs非臨床安全性評價研究策略

與其他藥物一樣，非臨床安全性研究貫穿于ONTs藥物研發的全生命周期。早期發現階段進行脫靶效應評估有助于確定成藥性好的臨床前候選分子；開發階段進行系統的非臨床安全性評價對于優化制劑處方、指導臨床給藥方案的制定、識別臨床不良反應或風險具有重要價值，并有助于提高臨床試驗申請成功率[7]。因此，制定合理的非臨床研究策略至關重要。

 

3.1早期發現階段進行多層級脫靶效應評估,見圖1

 

 

ONTs技術具有廣闊的應用前景，但同時也存在一定的脫靶風險，如免疫刺激反應、血小板減少、肝臟和腎臟毒性等。為在早期發現階段對可能的脫靶毒性進行評價，相關領域專家結合目前ASO的研究現狀和趨勢提出了一套系統的候選分子多層級脫靶效應評估策略[6]。本文參考上述思路并基于筆者的研究經驗總結了在早期發現階段對不同類型的ONTs候選分子（主要為ASO和siRNA）進行脫靶風險評估的策略。

首先，利用生物信息學工具從全轉錄組中預測可能與候選分子發生雜交的非目標序列，評估其潛在脫靶風險或篩選出特異性高的候選分子；對于存在與非目標序列發生雜交的候選分子，通過體外試驗比較該分子與目標序列和非目標序列的活性差異并確立安全活性窗口；對安全活性窗口較窄的分子進行更全面的風險評估，結合非目標序列的表達水平、生物學功能等評估脫靶效應可能產生的影響，并在后續的動物實驗中進行進一步的脫靶風險評估

此外，除了雜交依賴型脫靶毒性外，序列或化學修飾相關的雜交非依賴型毒性也是值得關注的內容。例如，ASO藥物的PS修飾本身可刺激免疫和激活補體，而中性骨架則沒有這種效應；凝血時間延長和血小板減少等毒性與化學修飾關系不大，更多與核苷酸序列本身相關；高親和力化學修飾，如鎖核酸（locked nucleic acid, LNA）更容易導致肝臟和腎臟的亞急性毒性。因此，在篩選策略上，應該根據候選分子的化學修飾和設計，優先評估與之最相關的潛在脫靶毒性。

3.2開發階段開展系統非臨床研究

對于ONTs，非臨床研究的核心目標是全面了解其安全性特征，以支持臨床開發和上市。建議參考ICH S6（R1）開展在靶毒性評價；對于脫靶毒性，建議采用生物信息學和人源細胞體外基因表達分析評估雜交依賴型脫靶毒性，參考化學藥物的方法評價雜交非依賴型脫靶毒性。非臨床評價除了常見的考慮因素（如相關種屬選擇、給藥途徑和劑量/暴露量）外，還應關注藥理學放大效應和替代分子的應用，毒理學研究需要根據相關適應癥或擬定的給藥方案進行設計。

目前，我國尚無專門針對ONTs非臨床研究的指導原則，可參考ICH M3(R2)等指南并結合ONTs產品特點開展必要的毒性試驗。一般來說，對ONTs的監管經驗與化學藥物相似，主要包括安全藥理學、一般毒理學、遺傳毒性、生殖毒性、致癌性試驗及其他與產品特性相關的毒性試驗等。由于ONTs具有某些治療用生物制品的特征，ICH S6（R1）中的某些建議有助于指導非臨床研究的開展。實際試驗中，應根據ONTs的序列、化學修飾和制劑處方制定具體的非臨床研究策略。此外，對于動物種屬的選擇是該類藥物非臨床研究的重要內容，將在第4部分進行詳述。

 

4.臨床安全性評價研究內容和關注點

4.1動物種屬的選擇

根據上文所述，ONTs的毒性分為在靶毒性和脫靶毒性。為了全面評價脫靶毒性，建議采用嚙齒類和非嚙齒類2種動物種屬；這2種動物種屬中至少有1種具有藥理學活性，以便對在靶毒性進行評價[5]。根據實際案例以及日本指導原則，當無藥理學相關種屬時，可僅在1種動物種屬中使用替代分子評價在靶毒性[5]。與替代分子相關的毒理學表現通常包括在靶效應、雜交依賴型和雜交非依賴型脫靶效應。由于序列不同于臨床分子，替代分子脫靶效應不代表臨床分子的安全性，應注意區分替代分子的在靶毒性和脫靶毒性[5]。

表3對已上市ONTs非臨床研究一般毒理學試驗所用動物種屬進行了匯總。這些藥物均在猴體內具有藥理學活性，在嚙齒類動物中是否具有活性取決于其核苷酸序列。根據各自的藥理學活性特點，均采用至少1種相關種屬考察在靶毒性，同時選擇合適的動物種屬評估其脫靶毒性。如Inotersen和Patisiran僅在食蟹猴體內有藥理學活性，一般毒性試驗中選擇食蟹猴作為相關種屬考察臨床分子的在靶毒性，選擇嚙齒類動物評估臨床分子的脫靶毒性；Lumasiran在嚙齒類動物和猴體內均具有藥理學活性，選擇大鼠和食蟹猴考察了臨床分子的毒性特征，包括在靶毒性和脫靶毒性。

綜上，ONTs非臨床研究應兼顧在靶毒性和脫靶毒性的考察，選擇2種動物種屬，其中至少在1種動物種屬中具有藥理學活性。

表3 已上市ONTs一般毒理學試驗動物種屬匯總

類別	通用名	給藥途徑	具有藥理學活性 動物種屬	一般毒理學試驗動物種屬
				小鼠	大鼠	兔	猴
ASO	Fomivirsen	ivt	兔、猴	√	×	√	√
	Mipomersen	sc	猴	√	×	×	√
	Eteplirsen	iv	猴	√	×	×	√
	Nusinersen	itt	猴	√	×	×	√
	Inotersen	sc	猴	√	√	×	√
	Volanesorsen	sc	猴	√	√	×	√
	Golodirsen	iv	大鼠、猴	√	√	×	√
	Viltolarsen	iv	猴	√	×	×	√
	Casimersen	iv	猴	√	√	×	√
	Tofersen	itt	猴	√	√	×	√
	Eplontersen	sc	猴	√	×	×	√
siRNA	Patisiran	iv	猴	×	√	×	√
	Givosiran	sc	大鼠、猴	×	√	×	√
	Inclisiran	sc	大鼠、猴	×	√	×	√
	Lumasiran	sc	嚙齒類、猴	√	√	×	√
	Vutrisiran	sc	猴	×	√	×	√
	Nedosiran	sc	猴	√	×	√	√

 

4.2安全藥理學試驗

建議參考ICH S7A《人用藥物安全藥理學試驗指導原則》對重要生理功能（如心血管、呼吸和中樞神經系統）的非預期影響進行評價，通常情況下可考慮采用整合試驗的方式，而不是開展單獨的安全藥理學試驗。由于ONTs不太可能作用于hERG等離子通道，開展體外hERG試驗意義不大[5,16,17]。如果在研發過程中發現了體內心血管相關的風險，可能需要開展針對性的體外研究。

Eteplirsen在相關試驗中可見對心血管和神經元的影響，Nusinersen因廣泛分布于脊髓和大腦，基于風險考慮，二者開展了單獨的安全藥理學試驗。除Fomivirsen外，已上市的所有ASO和siRNA均開展了安全藥理學試驗，但并非所有藥物均進行了hERG試驗（如Givosiran、Inclisiran、Lumasiran、Vutrisiran、Fomivirsen、Nusinersen、Eplontersen未開展該試驗）。

4.3單次給藥毒性試驗

日本指導原則中提及如果可從劑量遞增試驗、短期劑量范圍探索試驗、藥理學試驗或重復給藥毒性試驗中獲得急性毒性信息，可不開展單獨的單次給藥毒性試驗，這與ICH M3 (R2)中的建議一致。ICH S6 (R1)中也提到，作為藥理學或動物模型有效性試驗的一部分，通過進行單次給藥毒性試驗可收集到劑量-反應關系的信息。

鑒于ONTs在組織中通常具有較長的半衰期，非臨床研究中通常采用較長的給藥間隔。Eteplirsen、Inotersen、Golodirsen和Lumasiran等已上市藥物均未開展單次給藥毒性試驗，通過其它相關試驗對單次給藥毒性進行了評估。

4.4重復給藥毒性試驗

重復給藥毒性試驗重點評估ONTs在特定器官的蓄積情況和毒性反應。研究表明，一些經化學修飾、具有抗核酸酶活性的ONTs，長期給藥后可能會在特定組織如肝、腎等蓄積并產生毒性反應[18]，非臨床研究中常見高暴露靶器官的毒性反應，如肝腎可見嗜堿性顆粒聚集和空泡化等[15]。

大鼠經sc重復給予Lumasiran，在20、50和200 mg·kg-1劑量下均可見肝細胞輕微至重度空泡化，枯否細胞色素輕微增加和/或肝細胞輕度到中度核腫大，腎臟輕微至輕度嗜堿性顆粒和/或少量腎小管細胞空泡化；上述肝臟和腎臟相關改變均為非不良反應。綜合死亡率、臨床觀察、體重、生化指標等各項指標，未見不良反應劑量（NOAEL）為200 mg·kg-1。食蟹猴經sc重復給予Lumasiran，30 mg·kg-1劑量下可見堿性磷酸酶輕微升高，100和300 mg·kg-1劑量下可見肝臟枯否細胞輕微嗜堿性顆粒，由于程度較輕且未見對動物健康狀況的影響，NOAEL為300 mg·kg-1。與Lumasiran類似，其它已上市藥物的重復給藥毒性試驗至少采用2種動物種屬進行，通過臨床病理學、組織病理學和毒代動力學檢測，考察在不同劑量下的毒性反應特征和劑量-反應關系。

4.5遺傳毒性試驗

對于含化學修飾的ONTs，應參考ICH S2 (R1)進行遺傳毒性試驗。

由于ASO和siRNA藥物均進行了不同程度的化學修飾，故已上市藥物開展了遺傳毒性標準組合試驗。調研顯示，已上市ONTs在Ames、體外染色體畸變和體內微核試驗中均為陰性結果。盡管如此，隨著更多新化學修飾方式的引入，尚不能忽視ONTs潛在的遺傳毒性風險。某些經降解后可整合入DNA的化學修飾寡核苷酸也可能具有遺傳毒性[19]。

4.6生殖毒性試驗

建議參考ICH S5 (R3)并結合適應癥人群進行ONTs的生殖毒性（developmental and reproductive toxicity，DART）試驗。通常，采用嚙齒類動物進行生育力與早期胚胎發育毒性（fertility and early embryonic development，FEED）試驗和圍產期發育毒性（pre-and postnatal development，PPND）試驗，采用嚙齒類和兔進行胚胎-胎仔發育毒性（embryo fetal development，EFD）試驗。日本指導原則建議，當臨床分子在嚙齒類和兔中無藥理學活性時，推薦在嚙齒類或兔中采用替代分子進行EFD試驗，不推薦在非人靈長類動物中進行EFD試驗[6]。如證據權重分析（如作用機制、基因修飾動物的表型數據、同類分子的類別效應等）結果提示供試品存在對生育力或妊娠結局有明顯的不利影響，足以提示存在生殖毒性風險，則不需要開展額外的DART試驗。關于DART試驗的時間安排，參考 ICH M3(R2)。

表4對已上市ONTs DART試驗類型和所用動物種屬進行了匯總。Inotersen、Volanesorsen和Patisiran 等的相關種屬僅為猴，均采用嚙齒類動物開展了臨床分子和替代分子的FEED和PPND試驗；除mipomersen、nusinersen、inotersen、volanesorsen、tofersen、patisiran、nedosiran 、givosiran、inclisiran、lumasiran和vutrisiran同時采用嚙齒類和兔開展EFD試驗（mipomersen、nusinersen、inotersen、volanesorsen、tofersen和eplontersen采用 Ⅰ/II段生殖試驗組合的方式進行評價），其余僅采用嚙齒類開展EFD試驗。兔EFD試驗均采用了臨床分子，主要目的可能在于用臨床分子在第二個種屬中考察因脫靶毒性帶來的生殖毒性。考慮到杜氏肌營養不良癥（DMD）患者主要為男性，Eteplirsen、Golodirsen和Casimersen一般毒理學重復給藥中均未觀察到對雄性生殖系統的影響，故均未開展DART試驗。Viltolarsen的適應癥也為DMD，僅進行了雄性小鼠的FEED試驗。

4.7致癌性試驗

建議參考ICH S1A、ICH S1B和ICH S1C (R2)評估ONTs是否需要以及如何設計致癌性試驗。日本指導原則提出，當由于作用機制（如免疫抑制）存在致癌性擔憂，或遺傳毒性試驗、重復給藥毒性試驗或雜交依賴型脫靶毒性結果提示存在致癌性擔憂，則較難通過致癌性試驗排除這種擔憂，而是應該在考慮臨床風險和獲益的情況下適當地傳達致癌性風險[6]。

表5對已上市ONTs致癌性試驗的完成情況進行了匯總。Eteplirsen、Nusinersen和Lumasiran等在提交上市申請（NDA）時未完成致癌性試驗，一方面是因為現有的數據未提示致癌性風險，另一方面是結合臨床獲益-風險評估認為可將致癌性試驗可作為上市后要求；由于Inotersen在肝臟和腎臟中存在高暴露，Patisiran在雄性動物中可見細支氣管肺泡腺瘤，在NDA時完成了致癌性試驗，其中Inotersen采用了替代分子進行了評價。

4.8局部耐受性試驗

需評價品種制劑給藥的局部耐受性，可在重復給藥毒性試驗中伴隨，除非有單獨開展的理由。FDA批準上市的ONTs均在重復給藥毒性試驗中伴隨考察了對給藥部位的耐受性。

4.9免疫毒性試驗

某些類型的 ONTs 已知會激活先天免疫系統（如巨噬細胞、組織細胞、補體）。盡管通常無需開展專門的免疫毒性評估，但在一般毒性研究中評估 ONTs 誘導的免疫效應（如細胞因子、補體）可以提供有用的信息。可將免疫毒性試驗整合在重復給藥毒性等試驗中進行評價，相關要求參考ICH S8。

Eteplirsen、Nusinersen、Inotersen和Patisiran在重復給藥毒性試驗中進行了免疫毒性試驗相關指標的檢測，如白細胞系相關指標（Eteplirsen和Nusinersen）、C反應蛋白（Inotersen）、α1酸性糖蛋白（Patisiran）、免疫器官（淋巴結、胸腺、脾臟）組織病理學（Patisiran）、免疫細胞表型分析（Eteplirsen和Inotersen）等。

4.10光安全性評價

對于化學修飾的核酸如存在特殊的光安全性擔憂，應參考ICH S10進行評價。根據目前已上市產品的文獻資料，均未見光安全性相關評價，因此，光安全性評價建議具體情況具體分析。

4.11雜質限度的界定

ONTs的雜質分為寡核苷酸有關物質、有機小分子雜質、殘留溶劑和元素雜質。小分子雜質、殘留溶劑和元素雜質的評價參考ICH Q3和ICH M7；由于理化性質相似，寡核苷酸有關物質通常難以單獨分離，較難參考ICH Q3A進行界定，因此對于該類雜質的安全性評價應基于原料藥或制劑的研究結果（如雜質譜、毒性譜等）[5]。關于脫靶毒性的生物信息學分析可用于評估寡核苷酸有關物質的雜交依賴型脫靶毒性，如在生物信息學分析中包含了錯配序列，可以假定已對主要寡核苷酸有關物質的雜交依賴型脫靶效應進行了研究。如每種寡核苷酸有關物質的含量遠低于活性成分，則評價其雜交依賴型脫靶效應的意義不大[5]。對于ONTs，應盡可能在生產過程中減少雜質的產生，并根據藥學和非臨床研究數據、文獻資料綜合評價在人體中的安全性。

在Vutrisiran的非臨床研究中，共涉及6批樣品，其中3批含特定雜質（＞ 0.1%），NOAEL劑量下的雜質水平支持了臨床樣品雜質限度的制定。

4.12代謝產物和/或降解產物的安全性

研究顯示，天然核苷酸很容易經各種途徑清除，不太可能形成反應性中間體或破壞天然核苷酸儲庫和再循環途徑[20]；某些化學修飾，如PS和MOE不產生有毒代謝產物，這可減少對部分ONTs代謝產物的評價需求，而對于新的或不明確的化學修飾，可能需要進行更廣泛的代謝研究[7]。因此，對于可被核酸酶降解的天然核苷酸，其代謝產物或降解產物的安全性無需特別關注；但對于含有化學修飾的代謝產物和降解產物，需參考ICH M3 (R2)進行非臨床安全性評價。

Givosiran是通過將GalNAc配體與siRNA偶聯而實現肝臟特異性遞送的siRNA藥物，主要化學修飾為PS骨架、2'-氟（2'F）和MOE。試驗顯示，Givosiran在不同種屬血清中的穩定性相似，正義鏈比反義鏈更穩定，主要的活性代謝產物為AS(N-1)3’ Givosiran。大鼠（10 mg·kg-1）和猴（30 mg·kg-1）經sc給藥后，血漿中唯一活性代謝產物為AS(N-1)3’ Givosiran，暴露量占總物質的百分比分別約為17%和42%；臨床試驗中，Givosiran以2.5 mg·kg-1每月一次sc給藥后，血漿中主要代謝產物為AS(N-1)3’ Givosiran，穩態暴露量占總物質的百分比約為33%。在大鼠和猴重復給藥毒性試驗中，AS(N-1)3’ Givosiran的系統暴露量顯著高于臨床劑量下的暴露量（表6）。因此，大鼠和猴重復給藥毒性試驗充分評價了活性代謝產物AS(N-1)3’ Givosiran的安全性[21]。

表6 非臨床和臨床試驗中Givosiran主要代謝產物暴露情況匯總

 

4.13針對遞送系統的評價

對于遞送系統制劑，評價ONTs最終制劑的安全性是非常重要的，特別是當采用了LNP等特殊遞送系統時。ONTs的遞送系統在很大程度上影響著其安全性和有效性，應根據風險等級和已有的信息，采用適當的毒性試驗評價ONTs載體材料（如蛋白質、脂質、糖等）的安全性[5]。

Patisiran是第一個批準的LNP包裹的siRNA藥物，LNP中含有2種新的成分（DLin-MC3-DMA和PEG2000-C-DMG）。針對該LNP，在支持IND和NDA的研究中分別進行了體外hERG試驗、一般毒理學試驗、體內微核試驗和生殖毒性試驗（表7）。

 

5.結語與展望

作為一種新興的治療方法，ONTs具有巨大的應用前景，有望在更多的罕見性疾病、心血管疾病、代謝性疾病、傳染性疾病和癌癥領域展現出臨床價值。ONTs的毒性取決于多種因素，如序列設計、化學修飾、給藥方案（給藥途徑、劑量、持續時間）等。最常見的改變是肝臟、腎臟等高暴露組織的病理學變化和免疫反應[6,8,9]。已上市產品的非臨床研究較好地支持了臨床試驗的開展，其非臨床研究經驗為新的ONTs的開發提供了參考。在深度匯總和解讀已上市藥物非臨床研究案例的基礎上，本文根據國外監管機構和寡核苷酸安全工作組（OSWG）發布的相關建議和共識文件[22-24]，對ONTs非臨床安全性評價的策略和技術要點進行了闡述：1）在早期開發階段，開展多層級脫靶效應評估，充分利用生物信息學和體外模型對候選序列進行篩選，評估其與非靶標序列發生互補配對的可能性。2）在開發階段，分階段開展支持IND和NDA的一般毒理學試驗，并從兼顧在靶毒性和脫靶毒性評價的角度考慮非臨床安全性評價試驗動物種屬的選擇；結合供試品結構特點、化學修飾和遞送載體開展相應的遺傳毒性、生殖毒性和致癌性試驗。3）關注對代謝產物、雜質和/或降解產物的安全性評估。通過本文，期望為國內ONTs研發提供參考和借鑒。

隨著對非編碼RNA的深入認識，預計未來將會有更多類型的ONTs進入臨床試驗或上市。同時，需要考慮如何應對靶細胞遞送不足和脫靶效應等挑戰[25]。合理的序列設計、算法、化學修飾和遞送載體至關重要，減少脫靶效應和更深入地理解毒性機制有助于避免后期開發過程中的安全性問題，提高開發成功率。此外，新型體外模型的開發有助于提高預測性和敏感度。非臨床評價應在遵循指導原則的同時，結合具體產品的特點和臨床適應癥進行個性化考量。監管機構也在不斷積累和完善審評實踐，為ONTs的研發提供良好的指引。

 

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