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基于多種微生物鑒定技術的制藥企業環境微生物鑒定結果分析和應用研究

嘉峪檢測網 2025-07-28 19:24

摘要：目的運用多種微生物鑒定技術建立制藥企業無菌制劑高風險生產區環境微生物鑒定信息庫。方法連續4個季度對中間體、制藥用水、潔凈空間、人員設備表面等收集微生物，采用VITEK生化鑒定、MALDI-TOF MS蛋白鑒定和16SrRNA/ITS基因鑒定技術進行鑒定，結合微生物形態學和來源信息進行分析，建立相應的微生物鑒定信息庫。結果共收集獲得89株細菌和5株真菌的鑒定結果，開展相關形態學分析：在收集的94株菌中，革蘭氏陽性球菌和革蘭氏陽性芽孢桿菌共占比60.6%，是潔凈區常見污染菌；B級環境收集到46株微生物，葡萄球菌是主要優勢菌屬，占比45.7%，其次是芽孢桿菌(17.4%)、微球菌(6.5%)和酵母菌(4.3%)，B級還分離到1株洋蔥伯克霍爾德菌；制藥用水收集到29株微生物，主要為革蘭氏陰性菌(58.6%)。結論本研究建立了融合生化、蛋白、基因鑒定結果的微生物鑒定信息庫并開展相關分析，為制藥企業開展風險控制，加強對不可接受微生物的管理，開展微生物數據偏差調查和溯源分析提供依據；企業還可利用鑒定結果建立環境微生物地圖，有針對性地控制并消除微生物污染，提高無菌保障水平，確保藥品質量安全。

關鍵詞：VITEK；MALDI-TOFMS；16SrRNA/ITS；微生物鑒定

藥品微生物污染是影響藥品質量、引發臨床藥害事件的主要因素之一[1]。藥品生產區域范圍大，物料流轉線路長，產品接觸微生物概率高，藥品在生產過程中易受微生物污染，導致產品微生物指標不合格，輕者產品召回、企業利益和聲譽受損，重者則嚴重危害患者的身體健康。國內的“欣弗事件”和“刺五加事件”就是無菌藥品因受微生物污染而對公眾健康造成了嚴重危害和無法挽回的損失。微生物污染也是目前美國FDA藥品召回的主要原因之一，2015—2017 年，美國FDA 公布的藥品召回事件中，由微生物污染風險引起的召回事件占50%[2]。如何在藥品生產的各個環節嚴格把控微生物污染風險已成為保障藥品安全性的重要研究內容。實現藥品微生物的有效控制，需要實施有效的污染控制策略，即建立覆蓋藥品全生命周期的微生物污染監控方案和微生物快速鑒定方法，構建完善的制藥環境微生物鑒定信息庫，便于開展微生物污染調查與溯源分析，進而通過改善生產工藝，增加中間控制措施，改進清潔或消毒方法，加強人員管理等方式，靶向控制并消除微生物污染，更好地保障藥品的安全，這也是監管部門和生產企業努力的方向。

藥企對微生物的檢測由最初主要依賴人工的傳統檢測方法，包括觀察菌落形態、革蘭氏染色鏡檢、生化鑒定及血清學分型等，后來進展到自動化儀器檢測方法，包括VITEK 生化鑒定和基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)蛋白鑒定，再到近年來逐漸普及的基因序列鑒定等方法。相較傳統方法的操作繁瑣，耗時長，敏感度低且特異性較差，基因序列鑒定以其快速、準確、靈敏的優勢被廣泛應用于微生物鑒定及溯源領域，為藥企建立微生物數據庫提供了技術支撐。

本研究運用VITEK 生化鑒定、MALDI-TOF MS 蛋白鑒定和16S rRNA/ITS 基因測序鑒定3 種技術幫扶藥企進行快速鑒定并開展污染分析，進而探討微生物鑒定結果如何助力完善藥企微生物風險控制和質量保障體系。

1材料與方法

1.1 儀器、培養基和試劑

BX53 生物顯微鏡( 日本奧林巴斯)；Color Gram 12 染色儀、VITEK 2 COMPACT 微生物鑒定系統(生物梅里埃)；Microflex LT/SH smart 微生物鑒定質譜儀(德國布魯克)；ABI 3500 測序儀(美國賽默飛)。

HCCA portioned(德國布魯克，批號：602012 2059)；TSA 培養基(批號：1100645)、R2A 培養基(批號：1108435)均購自廣東環凱公司。

1.2 微生物的收集

連續4 個季度對轄區內某企業無菌制劑高風險生產區中的A/B 級(每次采集)、C/D 級和水系統(取關鍵點位采集)采集微生物，通過微生物限度檢測法(中間體和制藥用水)、沉降菌法、浮游菌法、接觸碟法(人員和設備表面)進行樣本采集及檢測，結果顯示，A 級環境控制良好，未分離到微生物，B 級共分離到46 株，C 級關鍵區域(如稱量室、配液室)18 株，D 級關鍵區域(洗瓶室)1 株，水系統關鍵取樣點(總送水點和總回水點)29 株菌。將收集的菌種進行分離、純化、鑒定，同時用磁珠保存管置−70 ℃保存。

1.3 VITEK 生化鑒定

VITEK 2 Compact 全自動微生物鑒定及藥敏分析系統是通過微生物的微量生化反應產生不同的濁度，再由光學儀器判讀，從而快速鑒定微生物。對分離純化獲得的菌株進行菌落形態學觀察、革蘭氏染色，然后根據鏡檢結果選擇相應鑒定卡，按照VITEK 2 Compact 操作程序進行生化鑒定。

1.4 MALDI-TOF MS 蛋白鑒定

MALDI-TOF MS 通過檢測微生物的蛋白質指圖譜來鑒定微生物。本研究采用甲酸提取法對菌株進行前處理，再取1 μL 上清液點樣于靶板，添加1 μL HCCA 基質，晾干，最后用Microflex LT/SH smart 微生物鑒定質譜儀分析鑒定。

1.5 16S rRNA/ITS 基因鑒定

16S rRNA/ITS 基因鑒定以特征核酸序列作為目標檢測物來鑒定微生物。細菌采用16S rRNA 基因(正向引物16SV1F 和反向引物16SV3R)，絲狀真菌采用ITS 區域序列(正向引物ITS5 和反向引物ITS4)，酵母采用D2 區域序列(正向引物D2_NL1和反向引物D2_NL4)，進行擴增、測序，測序結果拼接核對后，與經驗證的專業數據庫進行全局比對，基于相似度獲得菌種的鑒定信息。

2結果與分析

2.1環境微生物的鑒定結果

對無菌制劑高風險生產區進行12 個月的持續采樣收集微生物，通過VITEK 生化鑒定、MALDI-TOF MS 蛋白鑒定和16S rRNA/ITS 基因測序鑒定技術進行鑒定，共獲得89 株細菌和5 株真菌的鑒定結果，再結合樣本采集信息，初步構建了融合生化、蛋白、基因鑒定結果的環境微生物鑒定信息庫，見表1。由表1 可見，VITEK 生化鑒定和16S rRNA/ITS 基因測序鑒定成功率均為

表1 無菌制劑高風險生產區環境微生物鑒定信息庫

Tab. 1 Environmental microbial identification information database for high risk production areas of sterile formulations

采樣日期	采集來源	測序鑒定結果	質譜鑒定結果	VITEK 2 鑒定結果
2021.12.08	c	Chitinophaga varians	Unidentified	Sphingomonas paucimobilis
		多變噬幾丁質菌	無法鑒定	少動鞘氨醇單胞菌
2021.12.09	a	Pseudomonas juntendi	Pseudomonas monteilii	Pseudomonas putida
		順天堂大學假單胞菌	蒙太利假單胞菌	惡臭假單胞菌
2021.12.09	a	Comamonas testosteroni	Comamonas testosteroni	Comamonas testosteroni
		睪丸酮叢毛單胞菌	睪丸酮叢毛單胞菌	睪丸酮叢毛單胞菌
2021.12.09	a	Pseudomonas juntendi	Pseudomonas monteilii	Pseudomonas putida
		順天堂大學假單胞菌	蒙太利假單胞菌	惡臭假單胞菌
2021.12.09	a	Stenotrophomonas indicatrix	Stenotrophomonas maltophilia	Stenotrophomonas maltophilia
		指示器寡養單胞菌	嗜麥芽窄食單胞菌	嗜麥芽窄食單胞菌
2021.12.09	a	Comamonas testosteroni	Comamonas testosteroni	Comamonas testosteroni
		睪丸酮叢毛單胞菌	睪丸酮叢毛單胞菌	睪丸酮叢毛單胞菌
2021.12.12	e	Staphylococcus epidermidis	Staphylococcus epidermidis	Staphylococcus epidermidis
		表皮葡萄球菌	表皮葡萄球菌	表皮葡萄球菌
2021.12.14	b	Comamonas testosteroni	Comamonas testosteroni	Comamonas testosteroni
		睪丸酮叢毛單胞菌	睪丸酮叢毛單胞菌	睪丸酮叢毛單胞菌
2021.12.14	b	Comamonas testosteroni	Comamonas testosteroni	Comamonas testosteroni
		睪丸酮叢毛單胞菌	睪丸酮叢毛單胞菌	睪丸酮叢毛單胞菌
2021.12.20	b	Staphylococcus saprophyticus	Staphylococcus saprophyticus	Sta hylococcus saprophyticus
		腐生葡萄球菌	腐生葡萄球菌	腐生葡萄球菌
2021.12.20	b	Haematomicrobium sanguinnis	Unidentified	Microbacterium spp.
		未譯名	無法鑒定	微
2021.12.28	a	Stenotrophomonas indicatrix	Stenotrophomonas maltilia	Stenotrophomonas maltophilia
		指示器寡養單胞菌	嗜麥芽窄食單胞菌	嗜麥芽窄食單胞菌
2021.12.28	a	Brevundimonas vesicularis	Brevundimonas vesicularis	Sphingomonas paucimobilis
		泡囊短波單胞菌	泡囊短波單胞菌	少動鞘氨醇單胞菌
2021.12.28	a	Brevibacterium casei	Brevi acum casei	Brevibacterium casei
		乳酪短桿菌	乳酪短桿菌	乳酪短桿菌
2021.12.28	a	Tsukamurella pulmonis 肺冢村氏菌	Tsukam ella paurometabola 稍變(少代謝)冢村氏菌	Alicyclobacillus acidoterrestris /acidocaldarius
				酸土/酸熱脂環酸芽孢桿菌
2021.12.28	a	Sphingomonas pseudosanguinis	Sphingomonas pseudosanguinis	Sphingomonas paucimobilis
		假(偽)血鞘氨醇單胞菌	假(偽)血鞘氨醇單胞菌	少動鞘氨醇單胞菌
2022.01.05	c	Staphylococcus sap ophyticus	Unidentified	Staphylococcus saprophyticus
		腐生葡萄球菌	無法鑒定	腐生葡萄球菌
2022.01.06	c	Metaba llus idriensis	Lactobacillus paraplantarum	Clavibacter michiganensis
		傳染病研究所副芽孢桿菌	類植物乳桿菌	密歇根棍狀桿菌
2022.01		Staphylococcus hominis	Staphylococcus hominis	Kocuria rhizophila
		人葡萄球菌	人葡萄球菌	嗜根庫克菌
2022.01	d	Staphylococcus hominis 人葡萄球菌	Staphylococcus hominis 人葡萄球菌	Staphylococcus hominis ssp. hominis 人葡萄球菌人亞種
2022.01.12	d	Micrococcus antarcticus	Micrococcus sp.	Micrococcus luteus/lylae
		南極微球菌	微球菌屬	藤黃/里拉微球菌
2022.01.13	g	Paenibacillus glucanolyticus	Paenibacillus glucanolyticus	Cronobacter sakazakii group
		解葡糖類芽孢桿菌	解葡糖類芽孢桿菌	阪崎克洛諾桿菌群
2022.01.13	g	Paenibacillus glucanolyticus	Paenibacillus glucanolyticus	Paenibacillus amylolyticus
		解葡糖類芽孢桿菌	解葡糖類芽孢桿菌	解淀粉類芽孢桿菌
2022.01.14	g	Paenibacillus glucanolyticus	Paenibacillus glucanolyticus	Paenibacillus amylolyticus
		解葡糖類芽孢桿菌	解葡糖類芽孢桿菌	解淀粉類芽孢桿菌
2022.01.14	g	Paenibacillus glucanolyticus	Paenibacillus glucanolyticus	Paenibacillus amylolyticus
		解葡糖類芽孢桿菌	解葡糖類芽孢桿菌	解淀粉類芽孢桿菌
2022.01.26	e	Staphylococcus warneri	Staphylococcus warneri	Staphylococcus warneri
		沃氏葡萄球菌	沃氏葡萄球菌	沃氏葡萄球菌
2022.01.26	e	Staphylococcus ureilyticus 解脲葡萄球菌	Unidentified 無法鑒定	Staphylococcus cohnii ssp.urealyticus
				科氏葡萄球菌解脲亞種
2022.01.27	e	Staphylococcus borealis	Staphylococcus haemolyticus	Staphylococcus haemolyticus
		挪威北部葡萄球菌	溶血葡萄球菌	溶血葡萄球菌
2022.01.27	e	Staphylococcus saprophyticus	Staphylococcus saprophyticus	Staphylococcus saprophyticus
		腐生葡萄球菌	腐生葡萄球菌	腐生葡萄球菌
2022.01.27	e	Micrococcus luteus	Unidentified	Micrococcus luteus/lylae
		藤黃微球菌	無法鑒定	藤黃/里拉微球菌
2022.01.29	e	Staphylococcus capitis	Staphylococcus capitis	Staphylococcus capitis
		頭狀葡萄球菌	頭狀葡萄球菌	頭狀葡萄球菌

續表1

采樣日期	采集來源	測序鑒定結果	質譜鑒定結果	VITEK 2 鑒定結果
2022.01.29	e	Micrococcus luteus	Micrococcus luteus	Micrococcus luteus/lylae
		藤黃微球菌	藤黃微球菌	藤黃/里拉微球菌
2022.02.07	b	Meyerozyma guilliermondii	Candida guilliermondii	Candida guilliermondii
		季也蒙邁耶氏酵母	季也蒙假絲酵母	季也蒙假絲酵母
2022.02.07	b	Meyerozyma guilliermondii	Candida guilliermondii	Candida guilliermondii
		季也蒙邁耶氏酵母	季也蒙假絲酵母	季也蒙假絲酵母
2022.02.08	a	Paenibacillus typhae	Unidentified	Cronobacter sakazakii group
		香蒲類芽孢桿菌	無法鑒定	坂崎克洛諾桿菌屬
2022.02.08	a	Paenibacillus xylanexedens	Paenibacillus amylolyticus	Sphingomonas paucimobilis
		解木聚糖類芽孢桿菌	解淀粉類芽孢桿菌	少動鞘氨醇單胞菌
2022.02.08	a	Pantoea dispersa	Pantoea dispersa	Pantoea spp.
		分散泛菌	分散泛菌	泛菌屬
2022.02.09	g	Bacillus stratosphericus	Bacillus pumilus	Bacillus pumilus
		同溫層芽孢桿菌	短小芽孢桿菌	短小芽孢桿菌
2022.02.09	e	Staphylococcus lugdunensis	Staphylococcus lugdunensis	Staphylococcus lugdunensis
		路鄧葡萄球菌	路鄧葡萄球菌	路鄧葡萄球菌
2022.02.09	e	Micrococcus luteus	Micrococcus luteus	Micrococcus luteus/lylae
		藤黃微球菌	藤黃微球菌	藤黃/里拉微球菌
2022.02.09	c	Staphylococcus warneri	Staphylococcus warneri	Staphylococcus warneri
		沃氏葡萄球菌	沃氏葡萄球菌	沃氏葡萄球菌
2022.02.10	g	Bacillus cereus	Bacillus cereus	Bacillus cereus/Bacillus thuringiensis
		蠟樣芽孢桿菌	蠟樣芽孢桿菌	acillus mycoides 蠟樣/金/蕈狀芽孢桿菌
2022.02.17	g	Bacillus infantis	Bacillus infantis	Bacillus clausii
		嬰兒芽孢桿菌	嬰兒芽孢桿菌	克勞斯芽孢桿菌
2022.02.17	c	Staphylococcus cohnii	Staphylococcus cohnii	Staphylococcus cohnii ssp. cohnii
		科氏葡萄球菌	科氏葡萄球菌	科氏葡萄球菌科氏亞種
2022.02.19	c	Staphylococcus cohnii	Staphylococohnii	Staphylococcus cohnii ssp. urealyticus
		科氏葡萄球菌	科氏葡萄	科氏葡萄球菌解脲亞種
2022.02.19	c	Staphylococcus borealis	Unidentifie	Staphylococcus saprophyticus
		挪威北部葡萄球菌	無法鑒定	腐生葡萄球菌
2022.02.28	d	Alkalihalobacillus okhensis	us wakoensis	Sphingomonas paucimobilis
		奧卡港嗜堿鹽芽孢桿菌	和光芽孢桿菌	少動鞘氨醇單胞菌
2022.03.04	b	Metaba llus idriensis	Unidentified	Sphingomonas paucimobilis
		傳染病研究所副芽孢桿菌	無法鑒定	少動鞘氨醇單胞菌
2022.03.08	b	Bacillus lichenif mis	Bacillus licheniformis	Bacillus licheniformis
		地衣芽孢桿菌	地衣芽孢桿菌	地衣芽孢桿菌
2022.03.08	e	Moraxella loensis	Moraxella osloensis	Moraxella group
		斯陸莫拉菌	奧斯陸莫拉菌	莫拉菌群
2022.03.14	c	Sphingomonas aquatilis	Sphingomonas aquatilis	Sphingomonas paucimobilis
		水生鞘氨醇單胞菌	水生鞘氨醇單胞菌	少動鞘氨醇單胞菌
2022.03 22	g	Bacillus thuringiensis 蘇云金芽孢桿菌	Bacillus cereus 蠟樣芽孢桿菌	Bacillus cereus/Bacillus thuringiensis /Bacillus mycoides 蠟樣/蘇云金/蕈狀芽孢桿菌
2022.03.31	e	Rhodotorula mucilaginosa 膠紅酵母	Rhodotorula mucilaginosa 膠紅酵母	Rhodotorula glutinis/Rhodotorula mucilaginosa
				粘紅酵母/膠紅酵母
2022.04.01	e	Staphylococcus haemolyticus	Staphylococcus haemolyticus	Staphylococcus haemolyticus
		溶血葡萄球菌	溶血葡萄球菌	溶血葡萄球菌
2022.04.02	e	Staphylococcus petrasii subsp.petrasii	Staphylococcus petrasii	Staphylococcus warneri
		未譯名	佩氏葡萄球菌	沃氏葡萄球菌
2022.04.02	a	Brevibacterium celere	Unidentified	Brevibacterium casei
		速生短桿菌	無法鑒定	乳酪短桿菌
2022.04.05	a	Tsukamurella pulmonis 肺冢村氏菌	Tsukamurella paurometabola 稍變(少代謝)冢村氏菌	Alicyclobacillus acidoterrestris/ acidocaldarius
				酸土/酸熱脂環酸芽孢桿菌
2022.04.07	g	Bacillus pumilus	Bacillus pumilus	Bacillus pumilus
		短小芽孢桿菌	短小芽孢桿菌	短小芽孢桿菌
2022.04.10	c	Staphylococcus cohnii	Staphylococcus cohnii	Enterococcus faecium
		科氏葡萄球菌	科氏葡萄球菌	屎腸球菌
2022.04.11	a	Brevibacterium celere	Brevibacterium sanguinis	Brevibacterium casei
		速生短桿菌	血短桿菌	乳酪短桿菌
2022.04.13	a	Sphingomonas parapaucimobilis	Sphingomonas parapaucimobilis	Sphingomonas paucimobilis
		類少動鞘氨醇單胞菌	類少動鞘氨醇單胞菌	少動鞘氨醇單胞菌
2022.04.13	b	Chryseobacterium indologenes	Chryseobacterium indologenes	Chryseobacterium indologenes
		產吲哚金黃桿菌	產吲哚金黃桿菌	產吲哚金黃桿菌

采樣日期	采集來源	測序鑒定結果	質譜鑒定結果	VITEK 2 鑒定結果
2022.04.19	c	Pseudomonas zhaodongensis	Pseudomonas xanthomarina	Pseudomonas stutzeri
		肇東假單胞菌	黃色海假單胞菌	斯氏假單胞菌
2022.04.25	c	Meyerozyma guilliermondii	Candida guilliermondii	Candida famata
		季也蒙邁耶氏酵母	季也蒙假絲酵母	無名假絲酵母
2022.05.01	d	Micrococcus cohnii	Micrococcus cohnii	Alloiococcus otitis
		科氏微球菌	科氏微球菌	耳炎差異球菌
2022.05.01	c	Burkholderia cepacia	Burkholderia cepacia	Burkholderia cepacia group
		洋蔥伯克霍爾德氏菌	洋蔥伯克霍爾德氏菌	洋蔥伯克霍爾德菌群
2022.05.23	c	Dietzia kunjamensis	Dietzia maris	Dietzia spp.
		印度凍原迪茨氏菌	海迪茨氏菌	迪茨菌屬
2022.05.24	g	Meyerozyma guilliermondii	Candida guilliermondii	Candida guilliermondii
		季也蒙邁耶氏酵母	季也蒙假絲酵母	季也蒙假絲酵母
2022.05.25	g	Peribacillus simplex	Bacillus simplex	Bacillus simplex
		簡單近芽孢桿菌	簡單芽孢桿菌	簡單芽孢桿菌
2022.05.25	c	Paenibacillus campinasensis	Paenibacillus lactis	Sphingomonas paucimobilis
		坎皮納斯市類芽孢桿菌	乳類芽孢桿菌	少動鞘氨醇單胞菌
2022.06.06	c	Luteibacter anthropi	Unidentified	Aeromonas salmonicida
		人類藤黃色桿菌	無法鑒定	殺鮭氣單胞菌
2022.06.10	c	Microbacterium paraoxydans	Microbacterium paraoxydans	Sphingomonas paucimobilis
		副氧化微桿菌	副氧化微桿菌	少動鞘氨醇單胞菌
2022.06.14	e	Brevibacterium celere	Brevibacterium celere	Brevibacterium casei
		速生短桿菌	速生短桿菌	乳酪短桿菌
2022.08.09	d	Staphylococcus pettenkoferi	Staphylococcus pettenkoferi	Staphylo ccus capitis
		皮氏葡萄球菌	皮氏葡萄球菌	頭狀葡萄球菌
2022.08.14	c	Bacillus badius	Bacillus badius	Geobactoebii
		栗褐芽孢桿菌	栗褐芽孢桿菌	堆肥土桿
2022.08.25	c	Paenibacillus provencensis	Paenibacillus provencensi	Sphingom nas paucimobilis
		普羅旺斯類芽孢桿菌	普羅旺斯類芽孢桿菌	少動鞘氨醇單胞菌
2022.09.23	d	Kytococcus schroeteri 斯氏皮膚球菌	Kytococcus sc oeteri 斯氏皮膚	Dermacoccus nishinomiyaensis/ Kytococcus sedentarius 西宮皮球菌/坐皮膚球菌
2022.10.25	g	Cytobacillus oceanisediminis	Bacillus firmus	Bacillus firmus
		大洋沉積物纖維芽孢桿菌	強芽孢桿菌	堅強芽孢桿菌
2022.10.25	e	Naganishia diffluens	Crypto ccus diffluens	Cryptococcus albidus
		流散長西氏酵母	散隱球菌	淺白隱球菌
2022.10.28	b	Sphingomonas panaciterrae	Unidentified	Brevundimonas diminuta/vesicularis
		魚池鞘氨醇單胞菌	無法鑒定	缺陷/泡囊短波單胞菌
2022.11.01	b	Ponticoccus gilvus	Unidentified	Micrococcus luteus/lylae
		海滑行球菌屬	無法鑒定	藤黃/里拉微球菌
2022.11.02	c	Oceanobacillus kimchii	Oceanobacillus kimchii	Pasteurella canis
		泡菜大洋芽孢桿菌	泡菜大洋芽孢桿菌	犬巴斯德菌
2022.11.08	b	iestia aryabhattai	Bacillus megaterium	Bacillus megaterium
		阿氏普里斯特氏菌	巨大芽孢桿菌	巨大芽孢桿菌
2022.11.14	f	Staphylococcus capitis	Unidentified	Staphylococcus capitis
		頭狀葡萄球菌	無法鑒定	頭狀葡萄球菌
2022.11.28	d	Brevundimonas naejangsanensis	Brevundimonas diminuta	Brevundimonas diminuta/vesicularis
		內藏山短波單胞菌	缺陷短波單胞菌	缺陷/泡囊短波單胞菌
2022.12.22	f	Staphylococcus ureilyticus	Unidentified	Staphylococcus cohnii ssp. cohnii
		解脲葡萄球菌	無法鑒定	科氏葡萄球菌科氏亞種
2022.12.22	f	Staphylococcus ureilyticus	Unidentified	Staphylococcus carnosus ssp.carnosus
		解脲葡萄球菌	無法鑒定	肉葡萄球菌肉球亞種
2022.12.22	f	Streptococcus agalactiae	Streptococcus agalactiae	Streptococcus agalactiae
		無乳鏈球菌	無乳鏈球菌	無乳鏈球菌
2022.12.28	f	Staphylococcus epidermidis	Unidentified	Staphylococcus epidermidis
		表皮葡萄球菌	無法鑒定	表皮葡萄球菌
2022.12.29	f	Staphylococcus cohnii	Unidentified	Staphylococcus cohnii ssp. cohnii
		科氏葡萄球菌	無法鑒定	科氏葡萄球菌科氏亞種
2023.01.13	c	Staphylococcus borealis	Unidentified	Staphylococcus hominis ssp. hominis
		挪威北部葡萄球菌	無法鑒定	人葡萄球菌人亞種
2023.01.16	f	Cytobacillus kochii	Bacillus kochii	Brevibacillus choshinensis
		科赫氏纖維芽孢桿菌	科赫氏芽孢桿菌	銚子短小芽孢桿菌
2023.01.16	f	Janibacter limosus 泥兩面神菌	Janibacter indicus 印度兩面神菌	Alicyclobacillus acidoterrestris/ acidocaldarius 酸土/酸熱脂環酸芽孢桿菌
2023.01.16	f	Cytobacillus gottheilii	Unidentified	Brevibacillus choshinensis
		戈特海爾氏纖維芽孢桿菌	無法鑒定	銚子短小芽孢桿菌

注：a-純化水；b-注射用水；c-沉降菌；d-浮游菌；e-人員表面微生物；f-設備表面微生物；g-注射劑中間體。

Note: a-purifiedwater;b-waterforinjection;c-sedimentationmicroorganism;d-planktonicmicroorganism;e-microorganismonthesurfaceofpersonnel; f-microorganism on the surface of the equipment; g-injection intermediate.

100.0%(94/94)，質譜鑒定成功率為79.8%(75/94)。基于屬水平統計，質譜與測序鑒定結果一致的占比為68.1%；VITEK 與測序鑒定結果一致的占比為64.9%；企業可根據自己的需求選擇合適的鑒定方法，如多種技術鑒定結果有沖突，建議以測序鑒定結果為準。

無菌制劑高風險生產區環境微生物鑒定信息庫仍需要不斷完善，這是一個動態持續的過程。企業可根據鑒定結果開展相關分析，有針對性地控制并消除微生物污染，降低微生物負荷，提高無菌保障水平，為企業后續開展風險評估、溯源分析、污染調查提供技術支持，保障藥品質量安全。

2.2無菌制劑高風險生產區微生物形態學分析

通過形態學上統計分析可發現，革蘭氏陽性球菌占35.1%、革蘭氏陽性芽孢桿菌占25.5%、革蘭氏陰性桿菌占25.5%、革蘭氏陽性桿菌占7.4%、酵母占6.4%。革蘭氏陽性球菌和革蘭氏陽性芽孢桿菌共占比60.6%，是潔凈區常見污染菌類型。此企業環境微生物檢出最多的是革蘭氏陽性球菌，表明人員仍是潔凈區最大的污染源，這與報道的制藥企業日常微生物監控數據基本一致[3]。建議企業加強人員管理，提升所有員工的污染控制意識，最大程度降低由人員引起的微生物污染風險。同時要重視對芽孢桿菌的有效殺滅，該類菌的特點是細胞壁厚，孢子耐熱、抗氧化能力極強，是一類難以殺滅的微生物，國際上也將該類菌列為產品中不可接受微生物[4]。企業日常使用38%甲醛熏蒸等進行空間消毒，表明上述消毒方式未能完全消滅芽孢桿菌，因此需選用更強效的殺孢子劑。

2.3無菌制劑高風險生產區B 級環境微生物分析

A/B 級是無菌生產的核心區，對該區域監測到的微生物都要明確鑒定并采取控制措施。無菌制劑高風險生產區A 級未監測到微生物；B 級環境共檢出環境污染菌46 株，其中從人員表面分離的有18 株、設備表面7 株、沉降菌18 株、浮游菌3株。分析發現，葡萄球菌是主要污染菌，占比45.7%，芽孢桿菌占比17.4%，微球菌占比6.5%，酵母菌占比4.3%，伯克菌、短波單胞菌、鏈球菌、莫拉菌、鞘氨醇單胞菌分別占比2.2%，其他占比15.2%。葡萄球菌主要采集于人員表面，并以氣鎖室(出)、灌裝三更車間尤為明顯，此區域是人員更衣活動的主要場所，因此車間日常應注意控制潔凈區人員數量、加強更衣規范、減少人員的不必要活動。芽孢桿菌采集于沉降菌和設備表面，以滅菌后暫存室層流和軋蓋室尤為明顯，此區域與A級生產區緊密相連，需引起高度重視，說明車間日常應提高空間消毒頻率，設備表面消毒應選用適宜的殺孢子劑。

在粉碎混合包裝室用沉降菌法分離到1 株致病微生物—— 洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderia cepacia，BC)，其隸屬于洋蔥伯克霍爾德菌復合群(Burkholderia cepacia Complex，BCC)。BCC作為不可接受微生物[5]，能通過代謝調節、細胞形態改變，長期存活于土壤和水中，對細菌抑制劑和抗菌藥物有強大的耐受力，可在多種藥物中生長和增殖[6-7]。該位置分離到BCC 的可能原因為空間環境控制不當，BCC 通過物料攜帶或工具的傳遞進入潔凈區。因此出入人員應嚴格遵守更衣和物品傳遞程序，同時企業應制定科學合理的清潔消毒程序，盡量減少由人員和環境控制不當導致的污染。

2.4無菌制劑高風險生產區制藥用水微生物分析

水系統微生物的風險控制是藥品全生命周期質量管理的重要一環。在制藥用水關鍵取樣點共檢出污染菌29 株，其中純化水分離的有18 株，注射用水11 株。分析發現，水系統中污染微生物主要為革蘭氏陰性菌(從毛單胞菌、假單胞菌、鞘氨醇單胞菌和短波單胞菌等)，占污染微生物總數的58.6%，符合制藥用水系統中微生物絕大多數為革蘭氏陰性菌的報道[8]，見圖1。革蘭氏陰性菌在水系統中易形成生物膜，生物膜的檢測和去除十分困難，從而成為微生物污染的持續來源。此外，在制藥用水檢測到葡萄球菌，推測是來自人員取樣和檢測過程的不當操作，因此需要對檢測人員加強培訓，嚴格執行無菌操作，避免污染。

3討論

3.1企業加強對不可接受微生物的控制

企業通過建立環境微生物數據庫，確定對應自身生產環境的不可接受微生物列表，才能更有效地采取針對性手段，避免其最終污染產品。根據表1 可知企業檢測到致病菌BCC 以及種類多樣且高頻出現的芽孢桿菌屬等，對于出現的此類不可接受微生物，在今后環境監控過程中要格外注意采樣點，對每年環境檢測數據進行風險評估，針對高風險點可增加采樣頻次。從此次數據來看，人員、中間體為高風險區域，可增加采樣頻次，而一些經常被忽視的連接區域，比如原料混合包裝室、軋蓋區，也應引起重點關注。真菌，尤其是霉菌是潔凈區更不可接受微生物。真菌可以通過孢子繁殖，一旦污染很容易發生擴散，還能形成生物膜，難以殺滅，藥企必須加強這方面的防控。缺乏對真菌污染的有效識別是目前制藥行業的一個令人擔憂的現狀。準確的絲狀真菌鑒定技術通常使用18S rRNA/ITS 基因測序，也可選擇微生物質譜結合絲狀真菌數據庫來快速鑒定。

為預防不可接受微生物污染，藥企更要在源頭上進行控制，需制定有效的消毒滅菌手段，如提高空間消毒頻率，加強設備清潔，注意去除死角、不易清潔部位的塵埃，交替使用殺孢子劑等；還要制定更為合理的潔凈區人員管理程序及環境檢測程序，比如企業在制定環境檢測程序時，霉菌采集可選擇適宜霉菌生長的沙氏瓊脂培養基，采樣時應嚴格按照無菌操作，避免增加人員污染。在人員采樣方面，最好1人采樣1人復核，雙人操作使數據更加可靠。

基于多種微生物鑒定技術的制藥企業環境微生物鑒定結果分析和應用研究

圖1 無菌制劑高風險生產區水系統優勢菌檢出率

Fig. 1Detection rate of dominant bacteria in the water system of high-risk production areas for sterile preparations

3.2指導企業菌種鑒定手段的選擇

生化鑒定、蛋白鑒定和基因鑒定這3 種技術均有其適用領域及優缺點，菌種鑒定手段的合理選擇對于藥品質量控制來說至關重要。在實際應用中，藥企環境污染菌的鑒定可根據自身條件、鑒定目的、不同區域風險等級，綜合3 種鑒定方法的特點，選擇1~3 種不同的鑒定技術，組合成多相鑒定的整套方案[9]，以滿足控制菌檢查、環境監控、溯源分析、風險評估等需要，提高藥品微生物控制水平，更好地保障藥品質量。比如，對該企業來說，采集到的菌株來源如為潔凈區低到中等風險區域，日常污染菌鑒定采用VITEK 生化鑒定結合MALDI-TOF MS 蛋白鑒定技術，基本可滿足將菌種鑒定到屬水平，部分甚至能鑒定到種水平；對潔凈區風險較高的區域，比如B 級環境下的A 級層流、注射劑中間體等，采集的菌株可采用上述任一方法結合基因鑒定技術，基本可將菌株鑒定到種水平，達到分析要求。

3.3微生物數據偏差(microbiological data deviation，MDD)調查

微生物實驗室出現不合規范的結果通常稱為MDD。MDD 調查分為2 個階段，第1 階段僅限于實驗室內，焦點集中于確定試驗是否無效，第2階段是全面的調查，目的是確定產品不合格的根本原因。制藥環境微生物鑒定信息庫包括菌株來源、采樣時間、鑒定結果等相關信息，可為第2階段的調查提供技術支撐，尤其可為微生物污染的精準溯源奠定基礎。例如，企業如果在某次產品微生物限度檢驗中檢出BCC，建議企業偏差調查過程按下列步驟進行：首先進行實驗室調查回，查看有無微生物分析的明顯錯誤以及陰陽性對照出現問題等情況，排除試驗因素后，再開展全面調查(含生產調查)，包括人、機、料、法、環等環節，涵蓋近期實驗、生產環境的監測數據、水系統的檢測數據、空調系統的運行、壓差、設備和人員的消毒等以及和歷史環境微生物鑒定信息庫的比對情況(本次研究中在粉碎混合包裝室用沉降法檢出1 株BCC)，同時增加檢出批次以及前后各3 批終產品(包括原輔料)的多次檢測，實驗、生產環境增加環境監測頻次(包括沉降、浮游、表面采樣、懸浮粒子)，查看是否再次檢出BCC，從而判斷是偶發性原因還是真實污染；最后是開展微生物鑒定和溯源分析，比對同種菌的鑒定信息，包括VITEK、微生物質譜、16S rRNA 測序鑒定結果的一致性，有條件的實驗室還可以進行全基因組測序，進一步比對其同源性，根據試驗及比對結果開展溯源調查，精準定位污染區域，確定偏差原因，作出調查結論并進行批處置(銷毀或者符合工藝流程的再滅菌等)和對應的環境消殺、工藝改進等措施。

由于微生物試驗的固有特性導致MDD 調查難度大，基于制藥環境微生物鑒定結果分析的MDD調查方案的完善還需要多方面努力，包括長期持續收集環境微生物數據、快速精準地鑒定等。

3.4建立企業環境微生物地圖

微生物地圖是微生物監測數據和鑒定結果的可視化呈現，具體是指通過對藥品生產過程監控收集的污染微生物進行鑒定，從鑒定信息和采樣來源等方面進行分析，獲取藥品生產區域污染微生物的分布和遷移規律[10]。其應用于微生物污染防控中的效果取決于環境監測計劃中微生物采樣點的分布，采樣方式、采樣頻率的設置和鑒定策略的選取。采樣點的選取，應評估各取樣點的代表性，從最有可能導致產品污染的位置取樣，從而有效反映取樣環境的潔凈度；采樣方式為通過微生物限度檢測法(中間體和制藥用水等)、沉降菌法和浮游菌法(空間環境)、接觸碟法(人員和設備表面等)進行樣本采集及檢測；采樣頻率應根據環境的潔凈度等級、生產頻率、產品特性來決定。對收集的微生物選擇合適的方法進行鑒定，可將鑒定結果在生產車間平面圖上對應的區域標記出來，并用不同顏色表示不同微生物種類，不斷補充豐富，形成完善的環境微生物地圖，從而反映潔凈區微生物群落分布和轉變規律；通過密切關注重點區域微生物變化特點，在趨勢變化或發生異常時，可及時發現污染微生物及來源、推斷特定微生物可能的擴散路徑，并開展溯源分析和污染調查，進而降低終產品微生物污染風險。例如，本次研究在中間體中收集到1 株季也蒙邁耶氏酵母，此酵母之前在注射用水中檢出過2 次，3 株酵母根據鑒定信息進行同源性分析來源于同一株菌，中間體是在C 級背景下的配液室進行配制的，該房間使用最多的溶劑就是注射用水，根據微生物地圖推測該酵母可能是通過注射用水攜帶進入配液室并存活在該房間，進而污染該批次的中間體。

微生物地圖建成后，企業還可根據不同區域的微生物種群分布情況，選取不同的消毒方式進行有效消殺，增加染菌區域和人員手部的消毒頻次，提高無菌保障水平；也可從中挑選優勢菌及危害大的致病菌作為環境代表菌，以驗證消毒劑的消毒效果，這可以作為日常消毒是否有效的重要評價指標之一；培養基模擬灌裝試驗，除按照中國藥典要求加入促生長能力試驗使用的標準菌株外，也可考慮加入環境微生物地圖中顯示的優

勢菌。因此，建立環境微生物地圖是藥企管理環境污染菌的趨勢。

4小結

本研究采用多種微生物鑒定技術，建立了制藥企業高風險生產區域的環境微生物鑒定信息數據庫，并結合微生物形態學和來源信息進行分析，旨在幫助藥企在發現不良趨勢和異常時，能及時采取有效措施，防止污染事件發生。隨著研究的不斷深入，數據庫將會更加全面和完善，可為企業開展偏差調查、污染溯源以及日常微生物監控提供技術支持，并為監管部門實現高效監管和風險防控提供新思路。

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來源：Internet

基于多種微生物鑒定技術的制藥企業環境微生物鑒定結果分析和應用研究

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