雖然過去幾十年在減少、替代或優化非臨床研究中動物使用方面取得了進展，但在首次人體試驗之前，大多數新藥的安全性評估仍然依賴于動物實驗。除了監管要求外，嚙齒類動物、犬、小型豬、非人靈長類動物（NHPs）與人體之間生理相似性的過往經驗是繼續使用動物進行安全性評估的主要理由。然而，很多臨床研究中出現的不良事件，在動物研究中并未被觀察到?？赡茉从诜N屬間在吸收、分布、代謝和排泄（ADME）參數、遺傳學、靶基因表達等方面的差異。增強非臨床研究結果的可轉化性已成為藥物開發中重要的環節。

近年來，隨著新型治療藥物的增加，安全性評估的種屬選擇變得更加富有挑戰性。一些先進治療藥物（ATMPs），如細胞和基因療法、基于寡核苷酸的療法、靶向蛋白降解劑（TPDs）、抗體-藥物偶聯物（ADCs）以及雙特異性或多特異性抗體，通常對人類靶點具有高度特異性，但在其他種屬中可能沒有或缺乏藥理學活性，原因包括對同源靶點的親和力差異、靶點表達的完全缺失或人類與動物之間不同的下游信號通路。所以，非臨床動物研究在新形勢下面臨更多的挑戰。

ICH S6指南明確不鼓勵在非相關動物種屬中進行毒性研究。當不存在相關種屬時，指南建議使用轉基因動物或同源蛋白（“替代分子”）。ICH S6還建議進行體外研究，以協助選擇合適的動物種屬，例如受體占有率、受體親和力和/或藥理學效應的表征。EMA則鼓勵使用基于人類材料的體外方法。這兩份指南文件與FDA關于使用新方法學（NAMs）的趨勢一致，最終促成了FDA現代化法案2.0出臺。該法案允許制藥公司在適當的情況下使用替代方法來評估藥物的安全性和有效性，而不再強制要求進行動物試驗。NAMs指用于毒性測試的非動物替代方法，包括基于細胞的檢測、計算機模擬、器官芯片等。2025 年4 月10 日，FDA宣布計劃逐步取消單抗及其他藥物的動物實驗要求。使用“新方法論”（包括AI 計算模型、人類細胞系、類器官以及器官芯片系統等）替代動物實驗。再次使動物實驗的地位出現了一絲撼動。

不過，不同藥物形式具備不同的特點，也決定了所選擇的非臨床評價手段不同。對于小分子化藥，幾乎所有分子都存在脫靶結合，臨床前不太可能對所有脫靶情況帶來的人體風險進行全面評估。即使動物試驗也做不到，甚至動物可能會使一些出現“假陽性”的分子提前止步于非臨床階段。對于大分子生物藥，通常具有很高的特異性，主要毒性與靶點相關。NAMs的特點是，目前僅能針對特定問題進行研究，在處理復雜的安全性問題時，還是需要采用整體策略，比如動物實驗。所以，很明顯，對于生物藥物這類主要來自靶點介導毒性的分子，NAMs的適用性會更強。對于脫靶風險比較高的小分子化藥，NAMs遠不如動物實驗可靠。

來自BI、Sanofi、靈北、羅氏、GSK、輝瑞等企業的科學家根據藥物作用模式和靶點特點列出了4類藥物（如下圖所示），認為這類藥物可以使用體外人類模型替代或輔助動物，并給出了具體案例供參考，分享如下。

第一類：動物中缺少目標靶點

這類指的是候選藥物的靶點在動物中不表達或動物與人體靶點之間缺乏同源性。很明顯，這種情況沒有合適的動物模型可用于評估靶點相關的毒性。符合這個特點的大多是新型生物藥物（NBEs）。為應對這一挑戰，可以采用人類體外模型來評估藥物的療效和安全性。對于免疫調節療法，尤其是T細胞參與的免疫療法，這種方法尤為重要，因為這些療法幾乎完全是人類特異性的，不會與動物模型中的相應靶點發生交叉反應?？磶讉€案例。

案例1：IMCgp100（Tebentafusp）

IMCgp100是一種融合蛋白，由可溶性、親和力增強的T細胞受體（TCR）和抗CD3單鏈scFv抗體組成，旨在將表達gp100表位的癌細胞（通過HLA A*02:01）與表達CD3的T細胞結合。該藥物于2022年獲批用于治療葡萄膜黑色素瘤（商品名KIMMTRAK；Immunocore）。Gp100僅在人體某些類型腫瘤細胞中高表達，動物中缺乏該靶點。

對于IMCgp100及類似設計的雙特異性TCR基礎分子的非臨床療效和安全性評估，Harper等人開發了一套以2D人類癌細胞系為核心的純體外評估方案。在療效評估方面，使用抗原特異性、與適應癥相關的腫瘤細胞來測量抗原呈遞對靶細胞殺傷的影響。IFNγ釋放和腫瘤細胞體外殺傷的數據有助于計算最低預期生物效應水平（MABEL）。

安全性評估方面，將表達靶點的或不表達靶點的人類原代黑素細胞作為靶細胞，并使用單一供體的外周血單個核細胞（PBMCs）作為效應細胞，以研究靶向/非腫瘤活性。非靶向或非腫瘤效應通過使用人類全血進行細胞因子釋放試驗（CRA）和血小板激活試驗來評估，以評估廣泛免疫激活的風險。通過將效應T細胞與覆蓋獨特、最常見HLA亞型的廣泛人類原代細胞和細胞系共同培養，并使用ELISpot技術定量檢測IFNγ釋放，評估對替代HLA亞型的識別風險。同時，還采用計算機模擬方法，通過識別人類基因組中與靶點序列高度同源的肽段，進一步評估分子的安全性和特異性。

這些數據提供了關于IMCgp100的治療潛力、靶向與非靶向特異性以及潛在安全性方面的信息。這種方法用于確定首次人體試驗的安全起始劑量，并幫助推進該療法進入臨床開發。這種完全基于體外的非臨床評估方案代表了TCR基礎療法非臨床評估的潛在范式轉變，提供了一種更符合人類情況的動物替代方案。

案例2：MEDI-565

MEDI-565是一種新型雙特異性T細胞連接器（BiTE）抗體，旨在將表達癌胚抗原（CEA）的癌細胞與表達CD3的T細胞結合。研究表明，MEDI-565可與人類和食蟹猴的CEA結合，但不與食蟹猴的CD3結合，且嚙齒動物不表達CEA。MEDI-565的安全性評估方案包括用于食蟹猴的替代雙特異性抗體和人類CEA轉基因小鼠。然而，研究發現替代分子與MEDI-565相比具有非特異性結合介導的活性，以及不同的親和力、體外效力、動力學和T細胞激活幅度。最終決定不進行任何體內毒理學研究，而是采用純體外方法支持非臨床評估，并確定MABEL。

使用人類PBMCs和CEA陽性人類腫瘤靶細胞的共培養，通過多個合適終點（包括細胞因子釋放、腫瘤細胞溶解、T細胞激活和增殖以及受體占有率）來確定MABEL，采用最敏感終點的EC20計算。通過使用體外得出的MABEL濃度和食蟹猴PK研究數據預測的人類PK參數，確定了MEDI-565在表達CEA的癌癥患者中進行I期臨床研究的安全起始劑量。

隨后在患有晚期或難治性胃腸道腺癌的患者中進行的I期劑量遞增研究表明，腹痛和腹瀉是最常報告的不良事件之一。這與CEA在腸道內襯上皮細胞的表達有關。因此，在非臨床安全性評估中納入一個復雜的人類腸道細胞模型，例如能夠重現人類腸道上皮細胞三維結構和轉錄組的原代人類類器官模型，將有助于識別靶向毒性風險。

案例3：EpCAM和CEA靶向的T細胞連接雙抗（TCBs）

在2024年的研究中，Harter等人討論了靶向癌細胞上的上皮細胞黏附分子（EpCAM）或CEA以及T細胞上的CD3的TCBs。這些抗體被開發用于治療實體瘤，但在I期臨床試驗中出現了腹瀉這一副作用。這一副作用與EpCAM和CEA在健康腸道中的表達相關。對接受EpCAM靶向TCB治療的患者進行內窺鏡檢查顯示，上皮細胞受損，單核細胞浸潤到黏膜中，同時血清中炎癥細胞因子IFNγ、IL-6和IL-8水平升高。

在臨床前開發過程中，雖然使用了動物模型，但未能預測EpCAM靶向或CEA靶向TCBs以及CEA靶向嵌合抗原受體（CAR）T細胞的腸道風險。這可能是由于種屬間免疫學差異以及人類特異性亞型缺失或靶點在組織中的相關表達缺失。因此，研究人員調查了患者來源的腸道類器官是否可以再現由EpCAM/CEA靶向TCBs引發的臨床毒性。

將補充和共包裹了PBMCs的腸道類器官模型置于水凝膠中，并用EpCAM靶向TCB進行處理，監測通過caspase-3/7誘導的免疫介導的上皮細胞溶解。該模型還評估了CEA靶向TCBs的潛在毒性，測試了高親和力和低親和力分子（分別稱為CEAhi TCB和CEAlo TCB）。結果顯示，所有靶向黏膜的分子均在類器官中引發了強烈的時間和濃度依賴性凋亡誘導，證明了該系統對靶點表達和抗體親和力等參數的敏感性。例如，EpCAM靶向TCBs比CEA靶向分子引發了更快且更嚴重的類器官細胞毒性，這與EpCAM更高的可及性一致。同樣，CEAhi TCBs比CEAlo TCBs更具破壞性。重要的是，這些結果與臨床報告一致，即與CEA靶向雙抗相比，EpCAM靶向雙抗更頻繁且更嚴重地引發腸道不良事件。

這些發現表明，人類類器官可以提供一個強大且靈敏的試驗系統，用于模擬健康器官中的靶向TCB介導的毒性。證明了補充了PBMCs的健康患者來源類器官在捕捉癌癥免疫治療藥物（如TCBs）的免疫相關腸道毒性方面的有效性，這比動物模型具有顯著優勢，因為動物模型未能預測這些腸道風險。

第二類：存在種屬交叉問題的靶點

這種情況是候選藥物的靶點在動物中存在，但其表達水平或藥理學特性與人類不同。因此，動物模型在評估靶向毒性方面的轉化價值可能受到挑戰。例如，如果靶點在動物的某些器官中過表達或缺失，與人類相比，藥物候選物在動物中誘導的效應可能無法預測人類中的反應。這可能導致在動物模型中出現不相關的非臨床不良反應，或者更重要的是，動物模型中缺乏或低估了與人類相關的不良反應。即所謂的“假陽性”或“假陰性”。

如果第一類分子主要出現在NBEs中，第二類情況通常同時出現在NBEs和小分子化學藥物（NCEs）中。盡管第一類情況中描述的一些體外解決方案也可以在此類中使用，但目前完全不使用動物的測試策略并不現實。NCEs很少是100%靶向特異性的，大多會誘導非靶向效應。數據表明，小分子藥物可能會與大約6-12個非預期靶點結合。此外，動物中不同的靶點表達譜并不能排除靶向毒性的出現。因此，對于這一類別的化合物，體外測試將是對體內研究的補充，而不是完全替代，安全性評估方案主要由針對器官或組織特異性的體外測試組成，使用人類和動物的細胞模型來識別非臨床種屬與人類之間的差異。

案例1：BAY 2666605

作為支持抗腫瘤NCE BAY 2666605進入首次人體試驗的一部分，研究者開展了大鼠和NHPs的體內毒性研究。BAY 2666605能夠誘導兩個靶點PDE3A和SLFN12之間形成復合物，這兩個靶點在某些癌癥中過表達。其中一個靶點SLFN12顯示出高度的種屬特異性（在NHPs中序列同源性為90%，但在大鼠中僅為53%，且大鼠中沒有表達同源蛋白），而PDE3A在不同種屬間的同源性水平足夠高（小鼠和大鼠為84%、犬為90%、NHPs >98%）。然而，PDE3A-SLFN12復合物的形成尚未在NHPs中得到確認。在人類中，這兩個靶點的相互作用在多種癌癥模型中引起抗增殖和細胞毒性效應，從而有助于克服藥物耐藥。

在4周NHPs毒性研究中未觀察到毒性效應，表明其安全性良好。然而，由于在人類中，這兩個相互作用的靶點不僅在疾病組織中表達，還在主動脈組織中共表達，因此NHPs研究結果的轉化性受到質疑。然而，在NHPs中即使在高暴露水平下也未觀察到主動脈血管損傷。研究者決定使用體外實驗，比較人類和NHPs主動脈平滑肌和內皮細胞培養中的效應。結果顯示，人或NHPs主動脈平滑肌未見細胞毒性。人類主動脈內皮細胞中看到細胞毒性，但引發毒性的化合物濃度高于選定FIH起始劑量的預計最大游離藥物濃度。在NHP主動脈內皮組織中，也觀察到細胞毒性，出現毒性的濃度低于NHPs 4周毒性研究中達到的穩態最大游離藥物濃度，但體內毒理研究未見血管損傷的證據。因此，認為觀察到的體外效應不太可能直接轉化為臨床上相關的血管損傷風險。

由于BAY 2666605的兩個靶點在嚙齒動物中不表達，大鼠體內研究的價值僅限于評估NCE的潛在脫靶毒性。

案例2：SAR444559

SAR444559是一款抗CD38單克隆抗體，在食蟹猴單次和重復給藥毒性研究中觀察到再生性溶血性貧血。全血體外研究表明，在食蟹猴血液中，SAR444559處理后出現了濃度依賴性的紅細胞凝集，但在人類血液樣本中沒有觀察到這種現象。對食蟹猴和人類紅細胞上的CD38表達水平進行評估，結果顯示食蟹猴紅細胞上的CD38表達水平更高，這支持了毒性研究中觀察到的溶血性貧血是由于食蟹猴紅細胞上靶點表達更高而導致的種屬特異性靶點介導的反應。體外研究救了SAR444559一把，助力其推進到I期臨床研究。

第三類：哺乳動物中不存在的靶點

這一類也稱為“外來靶點”，指那些在動物或健康人類中不存在的藥物靶點。例如，針對傳染病的藥物靶向微生物蛋白，如果這些蛋白缺乏人類同源物，則不會產生靶點相關的毒性。類似情況也出現在人類疾病進展中被修飾的靶點上，如阿爾茨海默病中，神經纖維纏結中微管相關蛋白tau的病理性過度磷酸化在健康志愿者或用于安全性評估的健康動物中并不存在。

這種情況，開展人類細胞進行體外毒性測試能提供的幫助也很有限，反而計算機模擬（in silico）方法可能有助于調查脫靶毒性。當然，對于NCEs，仍然需要在標準動物研究中評估潛在的脫靶風險。

案例1：瘧疾藥物M5717

瘧疾由五種瘧原蟲引起。對于寄生蟲這種外來靶點，靶向毒性的評估并不容易實現?？梢钥紤]使用一些數據庫或其它工具，研究寄生蟲靶點蛋白序列與哺乳動物蛋白質組之間的潛在同源性。有助于先導化合物優化階段選擇對寄生蟲靶點具有更高選擇性的分子。

Merck Healthcare KGaA開發的抗瘧疾藥物候選物M5717是一種首創的小分子化合物，它抑制了多種瘧原蟲中細胞質蛋白合成的PeEF2。抑制PeEF2會影響瘧原蟲感染的紅細胞中的蛋白質合成。 M5717在濃度至少是瘧原蟲EC50的1000倍時，對HepG2細胞（一種人肝癌細胞）的蛋白質合成沒有抑制作用。說明該化合物選擇性地作用于瘧原蟲的靶點，不與人類蛋白發生交叉反應。

對于外來靶點，選擇毒理學種屬就不能依賴藥理學作用了，應基于藥物候選物的ADME特性以及代謝物譜。動物只能用于研究靶點以外的脫靶毒性。在進入II期臨床試驗的M5717案例中，尚未觀察到此類毒性。

案例2：核苷（酸）類似物

核苷（酸）類似物已被批準用于治療由單純皰疹病毒1型、HIV、HBV、HCV、流感病毒、呼吸道合胞病毒、埃博拉病毒和SARS-CoV-2引起的感染。這類藥物通常抑制哺乳動物中不存在的病毒DNA或RNA聚合酶。不過，有幾款藥物出現了針對哺乳動物蛋白的非靶向效應相關的安全性問題。

比如第一個被批準用于抗病毒治療的HIV-1逆轉錄酶抑制劑疊氮胸苷（AZT），與心肌病和乳酸酸中毒有關。1993年，一種用于HBV治療的核苷類似物—菲亞拉濱的II期研究因一名患者出現突發肝衰竭、休克和乳酸酸中毒而立即終止。在這項研究的最初幾周隨訪中，七名患者出現肝衰竭，其中五人死亡，兩人需要進行肝移植。對AZT、菲亞拉濱和其他核苷類似物的詳細研究表明，抑制人類線粒體DNA聚合酶γ及其導致的線粒體毒性是罪魁禍首。

抑制線粒體DNA聚合酶γ會導致鏈終止、復制失敗或核苷（酸）的插入，從而產生功能失調的蛋白。由于插入的核苷（酸）積累，可能會導致延遲毒性，這使得在較短期的IND支持性臨床前動物研究中難以檢測到。因此，這一類藥物的開發已演變為包括動物研究以及使用基于人類材料的支持性研究。

例如，針對HCV的NS5B聚合酶抑制劑索非布韋的臨床前安全性評估包括兩個種屬中的臨床前研究，以及在相關細胞系（如前列腺癌細胞系PC-3）中對線粒體功能的影響評估。體外線粒體功能的生化評估、重組線粒體DNA聚合酶γ和RNA聚合酶活性也被用于核苷和核苷酸類似物的安全性評估。

第四類：無法預測臨床事件的藥物

這類指的是不同種屬中與靶點表達狀態無關、導致人類特異性毒性發現的候選藥物。所有在人類中出現不良反應但未在非臨床動物研究中被檢測或預測到的藥物，都可以考慮使用人類相關體外模型進行回顧性機制毒性研究。

回顧性毒理機制研究也是新方法的一個重要應用方向。例如，對于藥物誘導的肝損傷（DILI），肝臟球體是很有前景的模型，預計這種模型在微生理系統（MPS）平臺中的應用將增加對人類特異性機制和動物研究轉化限制的理解。將人類組織的MPS與基于生理的藥代動力學（PBPK）建?；蚨肯到y毒理學（QST）相結合，以模擬和比較化合物暴露效應以及變化的代謝物（例如膽汁酸）譜，尤其具有前景。

案例1：BAY 1128688

BAY 1128688是一種選擇性抑制AKR1C3的小分子化合物，潛在治療子宮內膜異位癥。在該候選藥物的非臨床評估中，包括對雌性大鼠和食蟹猴進行為期4周或13周的重復給藥毒性研究。雌性大鼠為70 mg/kg BAY 1128688，雌性猴為40 mg/kg BAY 1128688，持續13周，被定為NOAEL。分別相當于預期人類暴露量的約21倍（大鼠）和16倍（猴），而預期人類最大臨床劑量為60 mg，每天兩次。

隨后，BAY 1128688在健康志愿者中進行了長達4周的多次給藥研究。在單次或多次給藥后，觀察到血清總膽紅素的劑量依賴性輕度增加，但未伴隨血清轉氨酶增加。在隨后的IIa期試驗中，涉及有癥狀的子宮內膜異位癥的成年絕經前女性，治療結束時（即治療超過8周后）檢測到肝毒性。在十名參與者（8.3%）中觀察到ALT從正常范圍上限的2倍增加到76倍。因此，試驗被提前終止。

分析發現，BAY 1128688是人類肝細胞攝取和外排過程（特別是膽紅素和膽汁酸運輸）中常見轉運蛋白的抑制劑（膽汁酸外排泵[BSEP]和多藥耐藥相關蛋白）。BSEP抑制是肝毒性最可能的原因，導致膽汁酸穩態改變和有毒膽汁酸在肝細胞中的積累。

這些膽汁酸穩態的改變顯然未在非臨床動物研究中得到充分反映，從而限制了對DILI風險的預測。人類的有毒疏水性膽汁酸比例更高，而嚙齒動物的毒性較小的極性膽汁酸比例更高。

動物研究未能識別潛在人類肝臟安全性問題，突顯了體外機制研究在識別人類DILI風險方面的重要性。使用QST建模工具DILIsym進行的機制研究顯示，抑制膽汁酸轉運蛋白可能導致膽汁酸積累和輕度肝毒性，盡管肝毒性的程度和時間進程預測得不太準確。

案例2：抗CD154單克隆抗體Hu5c8

傳統測試未能預測到Hu5c8在臨床試驗中觀察到的嚴重血栓。Barrile等人開發了一種名為“Vessel-Chip”的微工程模型，該模型模擬人類內皮功能，并評估Hu5c8引起的血栓形成反應。這種器官芯片（OoC）通過使用人類內皮和血液成分來密切模擬人類生理反應。利用該模型，使用疾病相關的可溶性配體sCD40L的濃度以及可能具有臨床相關性的Hu5c8濃度，研究人員在體外回顧性地揭示了Hu5c8的促血栓形成效應。作為血栓形成潛力的指標，Hu5c8誘導了纖維蛋白凝塊形成，這依賴于FcγRIIa受體。重要的是，這種效應未在Hu5c8-IgG2r（一種不結合FcγRIIa受體的抗體）中檢測到，表明新一代抗CD40L單克隆抗體可能具有低血栓形成風險。

案例3：SPC5001的腎毒性評估

SPC5001是一款反義寡核苷酸（ASO），動物研究未能預測到SPC5001在臨床試驗中引起的急性腎損傷。Nieskens等人使用腎臟近曲小管芯片模型來評估SPC5001誘導的腎毒性。結果表明，SPC5001在芯片上培養的人類腎近曲小管上皮細胞中誘導了細胞毒性，并增加了腎臟損傷生物標志物的水平，尤其是在延長暴露時間后。這些發現強調了腎臟芯片技術作為藥物開發中有價值的工具的潛力，用于評估腎毒性，提高對治療性ASOs人體反應的可預測性，從而減少對動物實驗的依賴。