在多肽純化過程中，含有額外色氨酸（Trp）的雜質(zhì)（如插入肽或序列錯(cuò)誤產(chǎn)物）因其與目標(biāo)多肽的疏水性、電荷狀態(tài)及紫外吸收特性差異，常需通過流動(dòng)相參數(shù)的精準(zhǔn)調(diào)控實(shí)現(xiàn)高效分離。以下從理論層面闡述針對(duì)此類雜質(zhì)的流動(dòng)相設(shè)計(jì)策略：

一、色氨酸雜質(zhì)的特性與分離挑戰(zhàn)

疏水性增強(qiáng)

色氨酸的吲哚環(huán)使其成為疏水性最強(qiáng)的天然氨基酸之一。若雜質(zhì)較目標(biāo)多肽多一個(gè)Trp，其整體疏水性顯著提高，在反相色譜（RP-HPLC）中保留時(shí)間通常延長。例如，目標(biāo)多肽含1個(gè)Trp，而雜質(zhì)含2個(gè)Trp時(shí)，兩者的疏水差異可通過乙腈梯度放大。

紫外吸收特性

Trp的吲哚環(huán)在280 nm處有強(qiáng)紫外吸收峰，而其他氨基酸（如甘氨酸、丙氨酸）在此波長吸收較弱。利用此特性，可通過調(diào)整流動(dòng)相的紫外截止波長（如選擇乙腈而非甲醇）避免背景干擾，并增強(qiáng)雜質(zhì)檢測(cè)靈敏度。

電荷分布差異

Trp的極性吲哚環(huán)在特定pH下可能參與氫鍵或偶極相互作用。例如，當(dāng)流動(dòng)相pH接近目標(biāo)多肽等電點(diǎn)（pI）時(shí)，雜質(zhì)的額外Trp可能通過側(cè)鏈極性基團(tuán)改變多肽整體電荷分布，從而影響其與固定相的靜電作用。

二、流動(dòng)相關(guān)鍵參數(shù)的調(diào)控機(jī)制

1.pH值的優(yōu)化

·  電荷差異放大：

調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH至目標(biāo)多肽的pI附近（如pH 5-7），可抑制目標(biāo)多肽的電離，使其疏水性占主導(dǎo)；而含額外Trp的雜質(zhì)可能因電荷差異（如鄰近酸性/堿性氨基酸）偏離pI，導(dǎo)致保留行為顯著不同。例如，某多肽pI為5.5，含額外Trp的雜質(zhì)因鄰近谷氨酸（Glu）使其pI降低至4.8，此時(shí)采用pH 5.5的流動(dòng)相可增強(qiáng)疏水分離。

Trp微環(huán)境影響：

Trp的吲哚環(huán)在酸性條件下（pH <6）質(zhì)子化傾向增強(qiáng)，可能通過疏水-π相互作用與固定相結(jié)合更緊密；而在中性pH下，其極性基團(tuán)暴露，疏水性相對(duì)降低。需通過實(shí)驗(yàn)梯度測(cè)試確定最佳pH窗口。

2.有機(jī)溶劑類型與梯度設(shè)計(jì)

乙腈與甲醇的選擇：

乙腈因洗脫能力強(qiáng)、黏度低，是分離疏水性差異顯著體系的首選。對(duì)于含多個(gè)Trp的雜質(zhì)，初始低乙腈比例（如20%-30%）可延長目標(biāo)多肽與雜質(zhì)保留時(shí)間的差異，而梯度斜率（如0.5%-1.0%/min）需根據(jù)疏水差異動(dòng)態(tài)調(diào)整。若雜質(zhì)保留過強(qiáng)，可采用甲醇替代部分乙腈以調(diào)節(jié)極性差異。

梯度分段策略：

例如，在純化含Trp的抗菌肽時(shí)，采用兩段梯度：20%-40%乙腈（10分鐘）洗脫目標(biāo)多肽，40%-60%乙腈（15分鐘）洗脫含額外Trp的疏水雜質(zhì)，可提升分離度至1.5以上。

3.離子對(duì)試劑與添加劑

三氟乙酸（TFA）的作用：

0.1% TFA作為離子對(duì)試劑，可與多肽的氨基形成離子對(duì)，增強(qiáng)疏水保留。對(duì)于含額外Trp的雜質(zhì)，TFA濃度可提高至0.15%以進(jìn)一步放大疏水差異。例如，某案例中TFA濃度從0.1%增至0.15%，目標(biāo)峰與雜質(zhì)峰的分離度從1.2提升至2.0。

抗氧化保護(hù)：

若Trp位于易氧化位點(diǎn)（如鄰近半胱氨酸），需添加1-5 mM DTT或TCEP防止吲哚環(huán)氧化，避免生成羥基化副產(chǎn)物干擾檢測(cè)。

4.緩沖鹽與離子強(qiáng)度

醋酸體系的選擇：

醋酸緩沖液（pH 3-5）可穩(wěn)定Trp的吲哚環(huán)結(jié)構(gòu)，同時(shí)通過調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度（如50-200 mM）抑制非特異性吸附。例如，醋酸鈉濃度從50 mM增至150 mM時(shí)，含Trp雜質(zhì)的峰寬減少30%，分離效率提升。

三、色譜柱與檢測(cè)條件的匹配

固定相選擇：

疏水性填料：C18柱適用于高疏水性雜質(zhì)分離，而苯基柱可通過π-π相互作用增強(qiáng)對(duì)Trp的選擇性。

·粒徑與孔徑：小粒徑（3-5 μm）填料可提高分離度，大孔徑（300 Å）色譜柱適應(yīng)含Trp多肽的構(gòu)象變化。

檢測(cè)波長優(yōu)化：

選擇214 nm（肽鍵吸收）與280 nm（Trp特征吸收）雙波長檢測(cè)，可同時(shí)監(jiān)控目標(biāo)多肽與雜質(zhì)。例如，在280 nm下，含額外Trp的雜質(zhì)峰面積較目標(biāo)多肽高2-3倍，便于定量分析。

四、應(yīng)用實(shí)例與優(yōu)化路徑

案例：GLP-1類似物中Trp插入雜質(zhì)的去除

背景：目標(biāo)多肽含1個(gè)Trp，粗品中混入含2個(gè)Trp的插入肽（純度85%）。

方案：流動(dòng)相：pH 5.0醋酸緩沖液 + 0.15% TFA，乙腈梯度從25%升至50%（梯度斜率0.8%/min）。

1.色譜柱：Luna C18（5 μm, 300 Å），柱溫30℃降低黏度。

2.結(jié)果：主峰保留時(shí)間8.2分鐘，雜質(zhì)峰10.5分鐘，純度提升至98.5%，分離度達(dá)2.3。

五、總結(jié)與展望

針對(duì)含額外Trp的雜質(zhì)，流動(dòng)相優(yōu)化的核心在于通過pH調(diào)控電荷分布、梯度設(shè)計(jì)放大疏水差異、離子對(duì)試劑增強(qiáng)選擇性。未來可結(jié)合分子動(dòng)力學(xué)模擬預(yù)測(cè)Trp與固定相的相互作用模式，并開發(fā)智能梯度系統(tǒng)實(shí)時(shí)優(yōu)化分離條件。此外，綠色溶劑（如超臨界CO?）替代乙腈的研究，為降低環(huán)境負(fù)荷提供了新方向。