樣品制備是 LC-MS 方法的第一步，對于提高靈敏度至關重要。

 

提高靈敏度的一個常用方法是：增加用于萃取的樣品量或進樣量。這種簡單易行的方法對于純凈的標準溶液非常有效。

 

然而，對于真實的生物樣品，如果缺乏適當的樣品制備過程來獲得干凈的樣品提取物，則可能無法達到預期的靈敏度提高效果。有時甚至會導致靈敏度下降，因為增加樣品體積或進樣體積也會增加提取樣品中的基質成分。

 

除了目標物之外，生物樣本中還存在各種內源性成分（如蛋白質、脂類、鹽類），它們的含量通常比分析物高得多。如果這些成分被帶入提取樣品中,并與分析物發生共洗脫，導致在質譜分析過程中（尤其是在使用電噴霧電離時），可能出現抑制或增強分析物的電離（基質效應）。

 

基質效應會嚴重影響 LC-MS 生物分析測定的靈敏度、準確度和精確度。回收率是正確的樣品制備策略需要考慮的另一個重要因素，因為一般來說，回收率越高，靈敏度就越高。

 

理想的樣品制備方法應能從生物樣品中 100% 地回收分析物，并去除所有基質成分，從而最大限度地提高靈敏度。

 

然而，在實際應用中很難實現理想的樣品制備。能提取大部分分析物的樣品制備方法可能也會提取大量基質成分，導致嚴重的基質效應（如果不能通過色譜法解決）。反之亦然，一種方法可以提取出非常干凈的樣品，但分析物的回收率卻很低。

 

因此，為了提高靈敏度，應同時評估基質效應和回收率，以獲得最佳的樣品制備方法，而這往往是兩者的折衷。

 

對于小分子分析物而言，蛋白質和鹽類相對容易從生物樣本中去除。磷脂由于同時具有疏水（兩個脂肪酸"尾部"）和親水（磷酸鹽"頭部"）官能團的兩親性質，通常很難去除。血漿中豐富的磷脂已被證明是小分子生物分析 LCMS 檢測中基質效應的主要來源之一。

 

因此，確保在樣品提取過程中有效去除磷脂已成為提高小分子生物分析檢測靈敏度、質量和穩健性的常用方法。

 

對于蛋白質分析物的 LC-MS 生物分析，生物樣品中的高豐度內源性蛋白質（如血清白蛋白、免疫球蛋白）是基質效應的主要來源。與蛋白質分析物相比，血漿/血清中這些內源性蛋白質的濃度通常要高得多。

 

其中一些蛋白質（或其消化后產生的肽）可能與蛋白質分析物（或其相應的替代肽）具有相似的理化性質，因此很難將其從感興趣的蛋白質（或肽）中分離出來，并可能導致嚴重的離子抑制、高背景噪聲以及對 LC-MS 分析的潛在干擾，從而嚴重降低檢測靈敏度。

 

目前已開發出多種樣品提取策略。對于小分子分析物，蛋白質沉淀（PPT）、液液萃取（LLE）和固相萃取（SPE）是最常用的樣品制備方法。對于多肽和蛋白質分析物，SPE、PPT 和免疫親和萃取（IAE）被廣泛使用。下表總結了這些樣品制備策略的優勢和局限性，接下來將詳細介紹。

 

表 1. 不同樣品制備方法的比較

 

注：+ 表示低；++ 表示中等；+++ 表示高

 

蛋白沉淀法（Protein Precipitation, PPT)

 

在 PPT 中，向生物樣本中加入變性劑，使大部分蛋白質從溶液中沉淀出來。然后通過離心等方法分離固態和液態成分，并對液態上清液進行分析。PPT 方法簡單、快速、成本效益高，通常可以實現很好的回收率，尤其是對小分子分析物而言。然而，由于其樣品凈化能力有限，在得到的上清液中仍會存在大量基質成分，這可能會對分析物造成嚴重的基質效應，影響檢測靈敏度。

 

此外，PPT 過程中不存在樣品濃縮的因素（事實上，樣品經常被稀釋！）。因此，PPT 通常不是提高檢測靈敏度的首選。

 

圖 1. 蛋白沉淀法示意圖

（圖片來源："Multi-step Preparation Technique to Recover Multiple Metabolite Compound Classes for In-depth and Informative Metabolomic Analysis". ）

 

PPT 可用于強蛋白質結合的分析物，因為它能有效地解離結合，將分析物從蛋白質中釋放出來，從而提高回收率并最大限度地提高靈敏度。

 

此外，由于 PPT 比 LLE 或 SPE 快得多，而且可以使用溫和的中性萃取條件（LLE 或 SPE 可能需要酸性或堿性條件），因此常用于不穩定化合物的萃取。

 

PPT 還可與其他樣品制備方法輕松結合。例如，維生素 D 及其代謝物主要以蛋白結合形式存在于血漿或血清中。在對其進行分析時，通常首先采用 PPT 步驟將分析物從維生素 D 結合蛋白中釋放出來，然后再采用額外的 LLE 步驟進一步純化樣品。

 

PPT 還可用于多肽和有機可溶性蛋白質的純化。例如，PEG 化蛋白質和小分子蛋白質在 PPT 所用的水溶性有機溶劑（如乙腈、甲醇和異丙醇）中具有一定的溶解度。只要適當優化 PPT 條件，這些分子就能被有效地保留在上清液中，并很容易從沉淀的背景蛋白中分離出來。

 

Zhang 等人在優化酸性沉淀溶劑和溶劑與血清比例的條件下，使用 PPT 從人血清中提取干擾素-γ 誘導蛋白-10（分子量為 8.6 kDa），實現了高回收率（近 100%）和最低基質效應。結果，他們獲得了一種高靈敏度的 LC-MS/MS方法，其 LLOQ 為 31.62 pM，與在緩沖液中分析純樣品的結果相同，比直接消化方法好 100 倍。

 

PPT 對于提取大分子蛋白質（如單克隆抗體 (mAb)）并不有效，因為大分子蛋白質大多會與血清/血漿樣品中的內源性蛋白質發生共沉淀。

 

最近，Liu 等人開發了一種新型的酸輔助 PPT 方法，可有效去除血漿/血清樣品中的白蛋白。白蛋白被保留在上清液中并被去除，而樣品中的大分子目標蛋白則被沉淀，然后重新懸浮以備進一步處理。他們評估了不同濃度的四種有機溶劑（丙酮、甲醇、乙醇和異丙醇）和兩種酸（甲酸和三氯乙酸）作為沉淀溶劑的組合。

 

他們發現，異丙醇與 1.0% 三氯乙酸的組合可從血漿中去除 95% 的總白蛋白，并對測試的三種治療蛋白（一種 mAb、一種結構域抗體和一種融合蛋白）達到令人滿意的回收率（>60%）。與傳統的 PPT 方法相比，這種新方法的提取物更純凈，因此大大提高了檢測靈敏度（對于所測試的治療蛋白，靈敏度提高了 10 倍）。

 

他們利用這種新方法成功驗證了一種 mAb 的 LC-MS/MS 方法，并將其應用于猴子毒理學研究。

 

液液萃取（Liquid–Liquid Extraction, PPT）

 

在液相色譜法中，雙相系統（通常是水溶液和不相溶的有機溶劑或溶劑混合物）的設置是為了利用分析物在相間的差異分布，通常是在萃取前通過調節 pH 值使分析物處于不帶電狀態。

 

通過適當選擇受體相的成分和體積，可以選擇性地萃取所需的分析物，并在可能的情況下進行濃縮。

 

LLE 能有效去除生物樣本中的蛋白質、鹽類和脂類，通常能得到比 PPT 干凈得多的提取物。它還易于在 96 孔板形式中實現自動化，操作簡單，可進行高通量提取，而且與 SPE 相比成本相對較低。

圖 2. 液-液萃取示意圖

（圖片來源："4.2: Overview of Extraction". Chem.Libretexts.Org, 2024, ）

 

因此，LLE 是一種常用的樣品制備方法，通常也是獲得清潔樣品提取物的首選方法。

 

為了實現基質效應最小化和分析物回收率最大化的最佳組合，需要仔細評估 LLE 的條件（如有機萃取溶劑、萃取緩沖液、pH 值以及樣品和萃取溶劑體積的比例）。有時，即使是萃取時間的長短也會極大地影響該方法的回收率和基質效應。

 

LLE 可使用多種不溶于水的有機溶劑（如乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、正丁基氯、正己烷和甲苯）。用不同的萃取緩沖液和 pH 值組合來篩選所有不同的溶劑既低效又耗時。

 

一種簡單的方法是篩選不同體積百分比的乙酸乙酯和正己烷混合物作為萃取溶劑，以及不同 pH 值（酸性、中性和堿性）的萃取緩沖液。

 

這種方法可涵蓋極性范圍廣泛的分析物：正己烷對非極性化合物具有良好的萃取效率，乙酸乙酯對中等極性化合物具有良好的萃取效率。

 

LLE 的一個局限性是其對極性化合物的適用性較差：這些化合物通常更易溶于水，無法被萃取到有機相中并獲得良好的回收率。出于同樣的原因，LLE 也很少用于肽和蛋白質的萃取。

 

鹽析輔助液液萃取（SALLE）是利用濃鹽溶液（如硫酸鎂、醋酸銨）在水相混溶的有機溶劑（如乙腈、四氫呋喃）中的鹽析效應，將含有目標分析物的有機溶劑“鹽析”出來，與水相分離。

 

與傳統的 LLE 方法相比，SALLE 在提取極性化合物方面更為高效。SALLE 還能提供比 PPT 更純凈的提取物，因為高濃度鹽和有機溶劑能有效沉淀生物基質中的蛋白質。

 

SALLE 已被應用于多種化合物的提取。對于傳統 LLE 或 SPE 方法難以萃取的極性化合物，SALLE 不失為一種提高靈敏度的有效方法。

 

固相萃取（SPE）

 

SPE 是一種基于色譜分離的萃取技術，可通過使用不同的吸附劑提供多種分離機制（如反相/RP、離子對、離子交換、混合模式）。

 

圖 3. 固相萃取示意圖

(圖片來源："Solid Phase Extraction". Mavink.Com, 2024）

 

因此，SPE 可對各種類型的分析物（包括非極性和極性化合物、肽和完整蛋白質）進行高效萃取。要獲得高靈敏度的檢測結果，最好選擇對分析物具有選擇性的分離吸附劑和機制。

 

SPE 方法的選擇性越高，得到的樣品提取物就越干凈，靈敏度也就越高。這種方法尤其適用于具有獨特物理化學特性的分析物，可通過選擇合適的 SPE 相加以利用。

 

例如，對于可離子化的化合物，使用離子交換分離機制的吸附劑具有高度的選擇性，因此可以實現高效的樣品純化并顯著提高靈敏度。使用強陽離子交換（SCX）固相萃取技術萃取堿性化合物就證明了這一點。

 

此外，固相萃取（SPE）還能方便地對樣品進行預濃縮或富集，這對于 96 孔板形式的 LLE 或 PPT 方法來說往往很不方便。例如，可將大量樣品（如 1 mL 或更多）裝入 SPE 板或濾芯，清洗后，分析物可在更小體積（如 100 μL）的溶劑中洗脫和復溶，這將使樣品得到顯著（10 倍或更多）富集。

 

這種預濃縮是提高靈敏度的一種非常有用的方法，尤其是在有足夠樣品量的情況下。

 

固相萃取也被廣泛用于從生物基質中純化肽和蛋白質。選擇合適的 SPE 吸附劑主要取決于分析物的極性和電荷（等電點，pI）。最常用的是反相吸附劑，也有報道稱使用離子交換材料。

 

對于小分子蛋白質和 PEG 化蛋白質，SPE 樣品制備可有效去除大部分內源性背景蛋白（如白蛋白和免疫球蛋白），并在提取物中保留完整的蛋白質分析物。對于單克隆抗體（mAbs）等大分子蛋白質，很難通過 SPE 直接從內源性蛋白質中分離出來。

 

另外，SPE 還可用于提取消化目標蛋白質的代肽。實現更好樣品純化的有效方法是使用與色譜分離正交的 SPE 分離機制。與使用與分析分離機制相同的 SPE 相比，采用與色譜分離機制不同的正交樣品制備通常能獲得更好的樣品純化效果。

 

在采用 RP 色譜分離的 LC-MS 方法中，Yuan 等人系統地比較了 SCX SPE、RP SPE 和二維 (2D) SPE（RP SPE 后 SCX SPE）對消化血清樣品的提取效果。SCX SPE 與 RP 色譜分離正交，在去除血清胰蛋白酶消化液中的背景肽方面比 RP SPE 更有效。雖然 2D SPE 對樣品進行了額外的凈化，但與單獨使用 SCX SPE 相比效果并不顯著。

 

組氨酸、半胱氨酸和色氨酸等氨基酸具有很強的電子供體基團，可以與 Ni2+、Zn2+ 和 Co2+ 等過渡金屬螯合。利用這種螯合作用，基于固定金屬親和力的萃取方法可以選擇性地萃取表面暴露有這些氨基酸的肽或蛋白質。

 

Wilffert 等人應用固定金屬親和層析法（IMAC）提取了血清中的重組人 TNF 相關凋亡誘導配體（rhTRAIL），這是一種 60 kDa 的蛋白質，含有大量表面暴露的組氨酸。rhTRAIL 的組氨酸與 IMAC 樹脂上固定的 Ni2+ 離子之間的強相互作用使樣品得以有效純化：95% 的血清蛋白被去除，而 rhTRAIL 被很好地保留下來，提取回收率為 72%。

 

二維固相萃取（2D SPE）具有額外的凈化維度，可進一步純化感興趣的多肽。

 

Wilffert 等人在 IMAC SPE 步驟之前增加了 SCX SPE 步驟，以定量檢測血清中的 rhTRAIL。這種 2D SPE 方法可去除 >99.9% 的血清蛋白。雖然 rhTRAIL 的總體回收率從 72% 降到了 49%，但更清潔的提取物使靈敏度提高了 10 倍以上。

 

在另一個例子中，Yang 等人在分析血清中的治療用 mAb 時，采用了先 RP SPE 后 SCX SPE 的方法。RP SPE 能有效去除鹽類和高度疏水的成分，而 SCX SPE 則能去除堿性與相關肽段差異很大的背景肽段，因此大大降低了背景噪聲、離子抑制和干擾，提高了 LC-MS/MS 分析的靈敏度。

 

免疫親和提取（IAE）

 

IAE 利用免疫親和捕獲試劑（如抗體或分析物的受體/配體）從生物樣品中選擇性地高效捕獲感興趣的分析物（蛋白質、肽或小分子化合物）。

 

對于蛋白質生物分析而言，由于樣品中存在高豐度的內源性蛋白質（或消化后的背景肽），傳統的樣品制備方法（如 SPE）往往無法提供足夠的樣品凈化，從而無法達到所需的靈敏度。

 

免疫親和素具有極佳的選擇性，非常適合從復雜的生物基質中提取和富集蛋白質或肽。近年來，基于免疫親和的樣品制備方法在蛋白質的 LC-MS 生物定量分析中引起了極大的興趣和關注。

 

圖 4. 免疫親和提取法示意圖

（圖片來源：Pichon, V. Immunoaffinity Extraction. In Reference Module in Chemistry, Molecular Sciences and Chemical Engineering; Elsevier, 2016;）

 

如果有合適的捕獲試劑，IAE 無疑是實現超靈敏方法的最有效的樣品制備方法，蛋白質分析物的 LLOQ 通常可低至 ng/mL。IAE 的純化效率取決于檢測中使用的捕獲試劑的選擇性：試劑的選擇性越高，目標分析物的富集和純化效果就越好，檢測靈敏度也就越高。

 

蛋白 A 或蛋白 G 可選擇性地與免疫球蛋白 G（IgG）的可結晶區片段（Fc 區）結合，因此可用于含有 IgG Fc 區的抗體的 IAE。然而，由于它們不能區分血漿/血清中的內源性 IgG 與相關分析物，因此只能提供有限的樣品純化和靈敏度提高。

 

與蛋白 A 或蛋白 G 相比，抗人類 IgG 抗體能大大提高選擇性，因為它只與人類 IgG 的 Fc 區域結合，而不與其他物種的 IgG 結合。它可以從動物基質中高效、高選擇性地純化各種人類 mAbs，從而顯著提高靈敏度。

 

這已成為提取動物血漿/血清和組織中人 mAbs 的通用免疫捕獲方法，也可用于同時提取多種 mAbs。

 

為了獲得更純凈的樣品提取物，IAE 需要選擇性更好的捕獲試劑。有兩種常用的蛋白質和多肽高特異性免疫捕獲策略。一種策略是使用抗生物體抗體或目標分析物的受體/配體來實現高選擇性純化和有效富集完整的分析物。這種方法已廣泛應用于各種蛋白質分析物，包括蛋白質或肽生物標記物。

 

另一種常用的方法是抗肽方法，名為 "穩定同位素標準和抗肽抗體捕獲"（SISCAPA），由安德森等人首次提出。在這種方法中，含有蛋白質（或大肽）分析物的樣品首先被消化成肽，然后使用抗肽抗體特異性地捕獲消化樣品中分析物的特征肽。

 

這種方法已應用于多種基質，包括血漿/血清、唾液、細胞裂解液、組織和 DBS。抗肽免疫捕獲具有高度的選擇性和高效性。通常可以獲得富集度大于 100 倍的極其干凈的樣品提取物；因此，這可以使靈敏度提高約兩個數量級。

 

與之前描述的抗接觸分析物方法相比，這種策略消除了抗藥物抗體 (ADA)、可溶性靶標或其他抗靶標蛋白抗體的潛在干擾，因為樣品在提取前已被消化。

 

為進一步提高靈敏度，可對目標蛋白及其特征肽進行連續免疫捕獲，以生成超凈、高富集的樣品提取物。

 

例如，Neubert 等人首次使用基于磁珠的抗神經生長因子（NGF）多克隆抗體從血清樣本中提取 NGF。樣本提取物經胰蛋白酶消化后，使用針對胰蛋白酶 NGF 特征肽生成的多克隆抗肽抗體進一步在線純化。

 

他們利用這種順序免疫捕獲方法實現了高靈敏度測定（LLOQ 7.03 pg/mL），可定量檢測血清中的人β-NGF。該方法已成功通過驗證，并已用于多項臨床研究的大規模樣本分析。

 

IAE 也被用于純化小分子分析物，但不如用于蛋白質和肽那么普遍。對于生物標記物而言，相關生物途徑中可能會產生同分異構體內源化合物，這可能會對分析物的 LC-MS/MS 分析造成干擾，影響檢測靈敏度。

 

IAE 可以有效消除樣品中的異構體干擾。在對血清中的 1α,25-二羥維生素 D 進行 LC-MS/MS 分析時，觀察到基質成分的嚴重干擾：多種異構體化合物與分析物發生共洗脫，并且它們具有相同的離子對。傳統的樣品制備方法無法完全去除或分離這些干擾化合物。

 

通過使用市售的 1α,25-二羥基維生素 D 提取試劑盒進行 IAE 步驟，成功地去除了所有干擾峰，實現了超靈敏方法，1α,25-二羥基維生素 D3 的 LLOQ 為 3.4 pg/mL，1α,25-二羥基維生素 D2 的 LLOQ 為 3.9 pg/mL。