目前溶出方法開發及驗證方面，USP<1092>講解的較為詳細，本文中的驗證一般要求，主要是參考了目前USP 2023版本的內容。在國內的指導原則，也明確指出了仿制藥溶出曲線檢測應該進行必要的驗證，如《普通口服固體制劑溶出曲線測定與比較指導原則》，指出“溶出試驗方法應能客觀反映制劑特點、具有適當的靈敏度和區分力”，“方法建立后應進行必要的驗證，如：準確度、精密度、專屬性、線性、范圍和耐用性等”；《化學藥品仿制藥口服固體制劑質量和療效一致性評價申報資料要求（試行）》指出“體外溶出曲線測定方法（含多個溶出介質）建立后，按照中國藥典2015版四部附錄〈9101〉藥品質量標準分析方法驗證指導原則進行必要的方法學驗證，如：準確度、精密度、專屬性、線性、范圍和耐用性等。”。
溶出曲線的驗證與溶出度相比，主要區別在于范圍。溶出曲線以第一個溶出點為低限，最終溶出量為高限；溶出度以標準溶出量為中間點進行研究，相比溶出度，溶出曲線的研究范圍要寬一些。
以溶出度方法學驗證為列，以下是我對于溶出方法學驗證的個人總結。
一、參考依據
溶出方法學較一般的含量方法學驗證，除了需要驗證分析（檢測）方法，還需要驗證溶出（溶出過程）方法。對于完整的溶出度方法學驗證，主要參照中國藥典、美國藥典以及ICH文件，如下：
● 中國藥典2020版，9101分析方法驗證指導原則。溶出度分析方法驗證指標包括：專屬性、準確度、精密度、線性和范圍、耐用性。
● USP〈1225〉 Validation of Compendial Procedures。
CATEGORY III：Analytical procedures for determination of performance characteristics (e.g., dissolution, drug release, and others).
● USP〈1092〉 The Dissolution Procedure Development And Validation。分析方法驗證指標包含專屬性、線性和范圍、準確度、精密度、耐用性；溶出方法驗證指標包含精密度、耐用性。溶出方法學驗證使用具有代表性的均一樣品。
● 【中文】ICH Q2（R2）：分析方法驗證（草案）（2023.11.01采納，2024年CDE發布的中文翻譯稿）。對其他定量測定，做出了說明，“如果工作范圍接近技術的檢測限度或定量限度，則其他定量測定可遵循雜質檢查方案，否則建議遵循含量測定方案”。同時將速釋制劑的溶出度方法學驗證作為其中的示例，溶出步驟的驗證指標為精密度、耐用性；分析方法的驗證指標為專屬性/選擇性、線性和范圍、準確度、精密度、耐用性，其中范圍下限是根據具體情況而定，如果工作范圍下限接近定量限，是需要驗證定量限的。
二、方法學驗證過程
（一）專屬性
目的證明溶出介質與輔料對樣品檢測無干擾；驗證過程及可接受標準來源 USP<1092>。
溶液配制
空白溶液：取溶出介質，按照供試品的處理方式進行處理（如過濾等）。
空白輔料溶液：取空白輔料混合樣品（含包衣粉、膠囊殼）適量（按處方比例及介質體積換算），在37℃的條件下，在溶出介質中溶解或分散，按照供試品的處理方式進行處理（如過濾等）。
供試品溶液：取空白輔料混合樣品適量（按處方比例及介質體積換算；緩控釋制劑，更建議采用空白制劑的方式進行），在37℃的條件下，加入溶出介質溶解或分散，按處方比例加入適量原料藥，使完全溶解（為確保溶解完全，也可按處方比例加入適量的原料藥貯備液），按照供試品的處理方式進行處理（過濾等）。
其他：當樣品在介質中不穩定，存在顯著降解，需要增加降解物的干擾實驗。
使用紫外法時：空白溶液測定，扣除比色皿+空氣空白；空白輔料溶液測定，扣除溶出介質空白；空白溶液測定時，扣除輔料空白。
上述供試品溶液，也可以用對照品溶液代替，按照以下計算公式計算干擾：
Result = (AP/AS) × CS × (V/L) × 100
AP=空白的吸光度值或響應值
AS=供試品溶液的吸光度值或響應值
CS=供試品溶液的主成分濃度（mg/ml）
V=介質體積
L=標示量（mg）
可接受標準
HPLC法：溶出介質、輔料均不干擾主峰檢出；主峰純度應符合要求。
UV法：按上述計算方式，溶出介質干擾應不超過1%；空白輔料干擾不得過2%。
（二）定量限/檢測限
應根據最小溶出量、釋放量決定是否需要進行檢測限/定量限考察。一般，緩控釋制劑以及遲釋制劑不釋放或幾乎不釋放的溶出介質中考察；速釋制劑無需進行該研究。需不需要做定量限可參照下述線性與范圍項下的描述。
HPLC法：采用對照品，用相應的溶出介質逐步稀釋進樣。LOD信噪比2:1或3:1；LOQ信噪比10:1。
UV法：按照公式計算。
LOD = 3.33δ /S ；LOQ = 10δ /S。
式中，δ：響應值的偏差；S : 標準曲線的斜率。
δ可以通過下列方法測得：① 測定空白值的標準偏差；②標準曲線的剩余標準偏差或是截距的標準偏差。
可接受標準
定量限定結果應符合準確度和精密度要求。連續進樣6針定量限溶液，主峰峰面積RSD≤10%。（也可根據中國藥典9101指導原則，表3 樣品中待測定成分的含量與精密度可接受范圍關系，制定相應的RSD值要求）
（三）線性和范圍
線性溶液配制：可用一貯備液經溶出介質精密稀釋，或分別精密稱樣，制備一系列被測物質濃度系列進行測定，至少制備5個濃度。以測得的響應信號作為被測物濃度的函數作圖，觀察是否呈線性，用最小二乘法進行線性回歸。
應注意，如果對照品/原料藥不易溶解，可考慮添加有機溶劑溶解制備貯備液，但最終線性溶液中有機溶劑的使用體積應小于5%。
可接受標準
r≥0.99（r2≥0.98，USP）
范圍：一般，溶出度限度的+20%，如規定限度范圍，線性范圍則為下限-20％至上限+20％。線性范圍下限接近0%，應進行檢測限/定量限的考察，線性范圍的下限應為定量限。詳細可參照下述各指導原則等，考察線性范圍。
（四）回收率
溶液配制
對照品溶液配制：按照擬定方法進行配制。
供試品溶液配制：取所有混合輔料（溶出檢測方法下的供試品100%濃度水平，應包含包衣粉、膠囊殼等），在37℃的條件下，加入對照品或已知含量的原料藥配制3種濃度，每種濃度3份樣品，加入溶出介質溶解，按擬定的供試品的處理方式進行處理（如過濾等）。加入對照品或原料藥的方式，可以為逐份準確稱量，也可以先配制貯備液，精密量取適量體積的方式進行。如使用有機溶劑制備貯備液，貯備液總有機溶劑體積含量應不超過5%。
3種濃度一般分別為線性范圍的低限、限度濃度（100%濃度）、線性范圍的高限
計算公式：回收率=測得量/加入量×100%
可接受標準
回收率范圍95.0%~105%（標準來源USP<1092>）
其他情況：對于特殊情況，如USP<711>中所述，第一階段釋放量不超過10%，第二階段釋放量不超過25%等，做回收率試驗具有挑戰性，可參照USP<1092>/5.Validating/5.3 Accuracy/Recovery項下內容。
（五）精密度
精密度試驗分為分析方法的精密度試驗與溶出方法的精密度試驗。可參照ICH Q2（R2）、USP<1092>中的內容。ICH Q2中區分了溶出方法的精密度試驗、分析方法的精密度試驗，溶出方法的精密度試驗使用一批具有代表性的制劑考察，分析方法的精密度考察使用1片制劑進行考察，備注中說明溶出方法的精密度研究將允許對制劑和分析的變異性進行綜合評估 ；USP中中間精密度對溶出方法和分析方法進行綜合評估，未給出具體的可接受標準。
精密度（分析方法）
重復性樣品配制
對照品溶液：按照擬定方法進行配制。
供試品溶液配制：
第一種方法（見ICH Q2（R2））：使用1個/片/粒制劑，用溶出介質完全溶解后，按照供試品處理方式（如過濾等）配制6個樣品；
第二種方法：與100%回收率樣品配制方法一致，配制6份樣品。
重復性可接受標準（分析方法）
同一對照品溶液連續進樣6針（HPLC法）/測定6次（紫外分光光度法），6次對照品溶液的響應值（峰面積或吸光度值），RSD＜1%；測得6份供試品溶液的溶出量，RSD＜2%（USP2023 <1092>）。
中間精密度樣品配制
不同試驗員、不同日期、不同液相/紫外分光光度計，按照上述重復性操作過程，配制溶出介質及樣品。
中間體精密度可接受標準（分析方法）
12份供試品溶液的溶出量，RSD＜2%。
精密度（溶出方法）
重復性樣品配制
對照品溶液：按照擬定方法進行配制。
供試品溶液配制：使用有代表性的均一產品，以溶出度檢測方法進行研究。取6片，使用溶出儀配制的溶出度樣品并依據擬定方法檢測。
注：如果沒有合適的產品，可以使用原料藥+輔料的形式，進行檢測。
重復性可接受標準（溶出方法）
溶出度RSD不超過10%，溶出量較低的情況可放寬至20%
中間精密度樣品配制
不同試驗員、不同日期、不同溶出儀、不同液相/紫外分光光度計，按照上述重復性操作過程，配制溶出介質及樣品。
中間精密度可接受標準（溶出方法）
12份溶出度RSD不超過10%，溶出量較低的情況可放寬至20%；
溶出度<85%的情況，兩次檢測樣品的溶出度結果平均值的差值的絕對值不超過10%，溶出度不小于85%的情況，兩次檢測樣品的溶出結果的平均值差值的絕對值不超過5%。
說明：中間精密度溶出度差值的絕對值要求的來源為USP<1092>，5.4.2 INTERMEDIATE PRECISION/RUGGEDNESS；溶出度RSD值的要求參考USP<1092>，2. METHOD DEVELOPMENT，原文“One guidance defines dissolution results as highly variable if the relative standard deviation (RSD) is more than 20% at time points of 10 min or less and more than 10% at later time points for 12 dosage units tested”，如果RSD超出20%或10%認為是高變異。這里參考的指南指的是USP<1092>參考文獻（15），詳細可查看USP<1092>。
（六）耐用性
耐用性同精密度一致，需要驗證分析方法的耐用性和溶出方法的耐用性。
耐用性（分析方法）
樣品配制
對照品溶液：按照擬定方法。
供試品溶液：1份；使用制劑溶解或100%回收率的做法。
同一般分析方法學驗證相同，液相色譜法中典型的變動因素有流動相的組成和pH值、不同品牌或不同批號的同類型色譜柱、柱溫、流速等。USP<1225>提到了改變檢測波長，目前國內是不改變波長的；對于紫外分光光度計法，一項變動因素是檢測波長。關于USP中描述原文見下方：
Robustness of analytical finish is referenced in <1225>. HPLC analysis parameters may include mobile phase composition (percentage organic, buffer concentration, pH), flow rate, wavelength, column temperature, and multiple columns (of the same type). For spectrophotometric analysis, the wavelength may be varied.
可接受標準（分析方法）
改變色譜條件后，與標準條件相比，應在98%~102%范圍內；每種條件下，系統適用性應符合要求。
耐用性（溶出方法）
ICHQ2：選擇溶出方法參數的依據，例如，溶出介質組成、緩沖劑或表面活性劑濃度、沉降片的使用、pH值、脫氣、容積、攪拌速率、采樣時間
USP<1092>
The parameters may include medium composition (e.g., buffer or surfactant concentration, pH, deaeration), volume, agitation rate, sampling time, and temperature. Statistical analysis of the data generated will help determine the extent to which the parameters must be controlled in the method.
參數可包括溶出介質組成（如緩沖液或表面活性劑濃度、pH 值、脫氧）、體積、攪拌速率、取樣時間和溫度。
對于溶出方法的耐用性研究，可作為方法開發過程中的內容。ICH與USP兩者基本一致，可作為參考。
樣品配制
對照品溶液：按照擬定方法。
供試品溶液：按照上述條件，每種條件從質量均一的制劑中取6片制劑考察，計算溶出度。
可接受標準
每種條件下，6片制劑的溶出度，RSD＜2%。
改變溶出條件后，與標準溶出條件下所測溶出度平均值相比，溶出度<85%的情況，差值的絕對值不超過10%，溶出度不小于85%的情況，差值的絕對值不超過5%。
（七）溶液穩定性
考察供試品溶液的穩定性，分別考察37℃、放置溫度（如室溫、冷藏等條件）兩種情況，考察對照品溶液、系統適用性溶液放置條件下的穩定性。考察時間考慮多批次檢樣、樣品配制過程等情況。
可接受標準
與0時樣品響應值相比，應在98%~102%范圍內。
三、溶出度、溶出曲線方法學驗證項目總結
