摘要
目的:為滿足基于風險評估的微生物控制體系及藥品質量全過程控制的要求,建立更加完善的藥品微生物鑒定溯源標準化分子生物學技術體系。方法:總結各國藥典中分子生物學標準體系的構成,并分析《中國藥典》中收載的分子生物學技術及該技術在藥品微生物鑒定溯源中的應用。結果與結論:分子生物學技術是進行藥品微生物鑒定溯源的重要標準,不同的分子生物學鑒定方法都有其優(yōu)勢和局限性,需要根據需求選擇最合適的方法，以期達到最佳效果。
一、 引言
藥品微生物污染是影響產品質量和用藥風險的關鍵因素,會對臨床患者尤其是免疫力低下人群造成致命威脅。近年來,安徽華源生物藥業(yè)“欣弗事件”黑龍江完達山藥業(yè)“刺五加事件"和“鹽酸奧布卡因凝膠污染微生物事件”等因微生物污染導致危害人民健康的事件都提示著藥品微生物污染已成為影響藥品質量安全的重要因素之一。如今，《藥品生產質量管理規(guī)范》(Cood Manufacturing Pmcticeof Medical Products,CMP)人用藥品技術要求國際協(xié)調理事會(The International Council for Harmonisa.tion of Technical Requirements for Pharmaceuticals forHuman Use,ICH)、國際藥品認證合作組織( Phama-ceutical Inspection Convention and Pharmaceutical Inspection Co-operation Scheme.PlC/S),美國注射劑協(xié)會(Parenteral Dng Association,PDA)等組織和相關法規(guī)對藥品生產過程的質量控制提出了更高的要求,如 PDA TR13 中建議 A級和B級區(qū)城中所有回收的分離菌株應進行物種確認:發(fā)生重大產品故障時,如介質溢出、無菌檢查陽性或發(fā)生其他嚴重異常事件時,需進行菌株水平的識別。《中華人民共和國藥典》(簡稱《中國藥典》)2020 年版微生物鑒定指導原則(通則 9204)中也提出:無菌試驗結果陽性、無菌生產模擬工藝(如培養(yǎng)基灌裝失敗)環(huán)境嚴重異常事件時,對檢出的微生物鑒定至少達到種水平,必要時需達到菌株水平。隨著國內外藥品法規(guī)的微生物控制理念由終產品控制向“全生命周期”過程控制轉變,需要對藥物原料、輔料、中間產品、終產品、制藥用水、環(huán)境等中檢測到的微生物進行鑒定溯源和風險評估。因此對藥品中的污染微生物進行“種"水平的準確鑒定是加強藥品生產過程控制,提升產品質量,降低用藥風險的有效手段,也是藥品微生物污染溯源分析的必要要求。
我國的藥品微生物檢驗工作全面開展起始于1973 年,50 年中從無到有逐漸組建了全國的藥品微生物檢驗隊伍和檢驗體系,建立了國家藥品衛(wèi)生標準和藥典標準。藥品污染事件的發(fā)生促使我們認識到全過程控制理念和藥品微生物檢驗能力建設的重要性和必要性。目前，中國藥典》在藥品微生物鑒定溯源上面臨著未形成規(guī)范化的技術要求體系,缺少權威、標準化的判定依據的局面,但隨著《中國藥典》2020年版四部中聚合酶鏈式反應法(通則1001)、DNA 測序技術指導原則(通則9108)標準核酸序列建立指導原則(通則9109)等標準的收錄分子生物學技術成為了藥品微生物鑒定湖源的主流技術,也是未來值得在藥典標準化方面持續(xù)推進和完善的技術領域。《中國藥典》2025 年版編制綱要突出強調了將全面完善基于風險評估的微生物控制體系,進一步強化藥品質量全過程控制要求，不斷護大先進成熟檢測技術的應用,持續(xù)推進分子生物學檢測技術體系建設，指出了我國藥品提高質量和醫(yī)藥產業(yè)升級的努力方向。
本文概述了藥典中分子生物學檢測技術體系的構架,介紹了聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Re.action,PCR),16S核糖體 RNA(16S ribosomal RNAI6S rRNA)測序技術、全基因組測序技術( Whole-genome sequencing,WGS)、基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜( Matrix-assisted laser desorption ionizationtime-of-flight mass spectmmetry,MALDL.TOF MS)等技術在藥品微生物鑒定溯源中的發(fā)展和應用情況。
二、 各國藥典分子生物學技術標準體系的構建
目前，各國藥典均收載了分子生物學技術用于藥品微生物質量控制的相關章節(jié)(表1)。我國藥典中分子生物學技術標準體系的構建起步較晚,2015 版《中國藥典》中藥品微生物鑒定方法主要基于形態(tài)學，生化反應等表型鑒定方法。但隨著 2020年版《中國藥典》第一個分子生物學檢查方法,聚合酶鏈式反應法(通則1001)的收載,我國藥典已陸續(xù)收載了6個分子生物學相關通則標準(表1)。自此我國藥典的分子生物學檢測技術體系從缺失的狀態(tài)逐漸走向完善階段，分子生物學標準體系的完善將為生物負載非無菌藥品中不可接受微生物控制和基于風險的藥品微生物全過程控制理念的落實提供技術支撐。
三、 分子生物學技術在藥品微生物鑒定溯源中的應用
微生物鑒定技術包括表型微生物鑒定技術和基因型微生物鑒定技術，實際應用中根據所需達到的鑒定水平(屬、種、菌株)選擇相應的鑒定技術，必要時可采用多相分類鑒定技術。表型鑒定方法操作簡單,尤其是自動鑒別系統(tǒng)的使用，是微生物的常規(guī)鑒定方法，但該方法依賴于培養(yǎng)方式和培養(yǎng)條件等，過程耗時，結果判斷較主觀。而且,從生產過程中發(fā)現的微生物由于受到藥品成分、營養(yǎng)不良或暴露于消毒和清潔劑等環(huán)境壓力中，微生物的表型特征的表達會受到不可預知的影響，導致鑒定結果不準確。分子生物學技術的研究對象是核酸和蛋白質等生物大分子，可以從生物大分子的結構、遺傳信息和代謝信息層面對菌株的種屬及來源做出判斷。因此,基于微生物核酸和蛋白組成的鑒定方法理論上更值得信賴。檢測結果更加準確,靈敏度高特異性強,目前已成為國內外藥品微生物鑒定的金標準。
3.1 聚合酶鏈式反應技術
1985 年 PCR 技術的發(fā)明催生了分子生物學技術的發(fā)展。PCR 技術模擬微生物 DNA 復制過程,在反應管中加人 DNA 模板、DNA 聚合酶、核苷酸、靶向特異性引物和其他試劑,通過變性-退火-延伸三個步驟,使目標 DNA 以指數擴增的方式快速增加至數百萬倍。除傳統(tǒng)的 PCR 技術之外,實時熒光PCR(Real-tme PCR)核酸等溫擴增技術(Isothermanucleic acid amplification technique)、巢式PCR( Nested PCR)、多重 PCR(Multiplex PCR).數字 PCR( Digital PCR)等技術也得到了廣泛發(fā)展。目前,PCR 技術已被 USP、EP 和 P等多國藥典收錄,用于藥品中動植物源性成分和微生物檢測。PCR 技術也是現代分子生物學技術體系中必不可少的關鍵步驟，可用于二代測序技術的文庫構建、酶聯(lián)免疫反應前置技術、免疫磁珠捕獲目標物 、質譜檢測目標物等。
3.2 測序技術
3.2.1 16S rRNA測序
細菌的核糖體 RNA(RNA)基因按沉降系數可分為3種,分別為5S、16S 和 23S rRNA 基因。其中,16S rRNA 基因最常用于細菌的物種鑒定。以 16S rRNA 基因系統(tǒng)發(fā)育學作為細菌分類依據的原因包括:(i)它存在于所有生物體中，并具有相同的功能:(ii)包含9個可變區(qū)(Variable region,V區(qū))和10個保守區(qū)Constantregion,C 區(qū)),保守區(qū)序列反映了物種間的親緣關系,而可變區(qū)序列則能體現物種間的差異:(ii)細菌16S rRNA 基因可包含足夠的信息進行鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析[。
細菌16SRNA 基因全長約1540 bp，前 500 bp序列變化較大，包含豐富的種屬特異性信息,顯示出較好的分辨率和多樣性。通過16S rRNA前500bp序列和1500bp序列鑒定菌株結果的比較93.7%的樣本能得到相同的鑒定結論。因此，一般僅需擴增前 500 bp 序列，或使用高信息量的可變區(qū)(如 V1-V3)也足以滿足日常鑒定需求。當然，不同的可變區(qū)在識別特定細菌的分類上也可能顯示出不同的偏好，如 V1-V2 區(qū)和 V3-V5 區(qū)分別對變形桿菌門和放線菌門進行分類時效果不佳。在屬水平上，V6-V9 區(qū)是梭菌屬和葡萄球菌屬分類的最佳區(qū)域。V3-V5 區(qū)對克雷伯菌屬鑒定效果好，V1-V3 區(qū)對埃希氏菌屬/志賀菌屬能給出較好的鑒定結果，V4區(qū)鑒定能力最差。當以 99%相似性進行 OTU 聚類分析時，V1-V9 和 V1-V3 區(qū)域可有效反映“種”水平變異。
在測序結果判定方面，獲得的核酸序列需要與儀器專用數據庫或公共數據庫中已知的核酸序列進行比對分析,核酸同源性>98.65%可判定為同一菌種。參比序列大多來源于 NCBI、EMBL、DDBJ.SILVA、GreenGenes、RBD 等數據庫，用戶通過在線比對分析后，依據核酸相似度判定結果。公共數據庫中的序列由提交者上傳，數據信息未經過嚴格審核。當使用公共數據庫序列比對時,數據質量不佳或分類注釋不準確極有可能導致鑒定結果錯誤。因此,在序列對比之前需評估數據質量,使用經過驗證的數據庫或公認的參考數據。
16S rRNA 基因序列分析已成為藥品微生物鑒定的金標準方法，被廣泛應用于諸如凝固酶陰性葡萄球菌、鏈霉菌屬、芽孢桿菌屬等藥品微生物的鑒定分析中。但 16S rRNA 鑒定受限于特征核酸序列片段的有限分辨力而無法實現近緣微生物鑒定以及分型溯源,如不能正確識別頭葡萄球菌(S. capiis)和木糖葡萄球菌(S. xylosus),因為這兩株菌的 16S rRNA 基因序列無顯著性差異。因此需要分辨力更高、覆蓋范圍更廣的藥品污染微生物鑒定溯源方法。
3.2.2 全基因組測序
全基因組測序是利用高通量測序技術對微生物個體的整個基因組序列進行測定,獲取遺傳信息的過程。全基因組測序技術主要包括第二代測序技術(又稱下一代測序技術，NextGeneration Sequencing,NGS)和基于單細胞測序Single cell genome sequencing)的第三代測序技術全基因組測序可獲得微生物完整的遺傳信息,包括外顯子測序或靶向測序無法獲得的核酸信息。隨著近年來測序技術的不斷進步、測序成本持續(xù)降低,使得全基因組測序變得觸手可及。
全基因組測序技術的一般流程包括測序樣本的獲得、測序文庫的構建、全基因組測序和數據分析等。全基因組序列數據除了能提供菌株的分類鑒定信息，還可提供菌株毒力因子、耐藥性及有毒代謝物產生等特性信息。全基因組測序的平均核苷酸同源性(Average nucleotide identity，ANI)分析可將微生物鑒定至“種”水平，ANI值為 95%被視為界定種的標準。Zhang 等[2]通過計算比較了1226 個細菌菌株全基因組序列間的 ANI值，發(fā)現屬于同一種的菌株間 AN 為 93.6%,同一屬的菌株間 ANI 值為83.6%,而同一科菌株間 ANI為 78.9%。Kim 等通過研究 16S rRNA 基因序列相似性的值和 ANI 值之間的相關性時發(fā)現用來區(qū)分兩個不同種的98.65%的16S rRNA 基因相似性值與 95%~96%的 ANI 值相對應。相比于 16S rRNA 技術，全基因組測序技術由于測序通量較大(Mbp)，在數據分析技術難度、檢測成本、參考數據庫和標準化等方面均存在較大的挑戰(zhàn)。2022 年 11月29 日國家藥典委員會發(fā)布了“關于微生物全基因組測序技術指導原則草案的公示”該指導原則的制定將規(guī)范微生物全基因組測序的方法流程和技術指標，為藥品全生命周期質量控制中微生物的精準鑒定、溯源分析和風險識別等提供標準指導。
3.3 MALDITOF MS 法
MALDI-TOF MS 法是基于微生物核糖體等高豐度穩(wěn)定表達的特征蛋白(相對分子質量2000~20 000)指紋圖譜的快速鑒定技術。由于核糖體蛋白具有保守性,一般不會隨生長條件的變化而變化,而不同微生物的核糖體蛋白指紋圖譜具有各異性,指紋圖譜中的某些特征峰具有屬、種,甚至亞種特異性,是鑒定細菌和酵母的可靠方法,被認為是替代基因型方法最有前途的技術之一。
MALDI-TOF MS 鑒定微生物的流程主要包括樣品準備、質譜測量和數據分析等,通過比較目標樣品譜圖與己知數據庫中的參考譜圖的相似性,根據預設的統(tǒng)計學閾值保留最接近的菌種或菌群結果，實現微生物的快速鑒定。因此,使用可靠、經驗證的參考數據庫是 MALDI-TOF MS 準確鑒定的重要條件之一。當數據庫未包含待測菌種分類信息時,可通過自建庫方式完善質譜數據庫,以提高鑒定的準確率。自建庫時,需要對待入庫微生物進行詳細準確的多項分類鑒定,結合傳統(tǒng)生化反應和分子生物學技術確認菌株種屬分類,以保證自建庫的數據質量。自建庫對微生物培養(yǎng)條件、采集圖譜數量、模式菌株的選擇等均需進行嚴格的質量控制和有效性驗證。
MALDI-TOF MS 已逐漸成為微生物菌種鑒定的標準方法。如中國國家標準委發(fā)布的《基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜鑒別微生物方法通則》(GB/T 33682-2017)及美國臨床和實驗室標準協(xié)會(CISI)發(fā)布的《Methods for the Identification of Cul-tured Microorganisms Using Matrix-Assisted Laser
Desorption/lonization Time-of-Flight Mass Spectrome.y》,均已將 MALDI-TOF MS 方法的應用標準化和規(guī)范化。目前,該方法因成本低、檢測速度快、通量高等優(yōu)勢已廣泛應用于藥品微生物的鑒定。
除了上述討論的分子生物學技術外,18sRNA/ITS 測序已被廣泛應用于藥品中真菌的鑒定,而宏基因組技術可在特定環(huán)境中對包括細菌、真菌、病毒等全部微生物作為研究對象,可實現對已知和未知微生物的檢測,有利于新物種的發(fā)現。
四、 結論
分子生物學技術是實現藥品生產工藝和生產環(huán)境中污染微生物“種”水平準確鑒定的重要技術手段。針對我國藥品微生物鑒定領域中共性存在的“缺乏系統(tǒng)的鑒定體系、缺乏權威的判定標尺、缺乏嚴謹的國家標準”等瓶頸問題,我國藥典創(chuàng)新性提出并構建了集“先進鑒定技術+云數據庫+國家標準”于一體的藥品微生物鑒定多維關鍵技術及標準體系,有效解決阻礙我國醫(yī)藥產業(yè)高質量發(fā)展和走向國際的技術壁壘。該體系的建設首先通過對“一代核酸測序、高通量測序、MALDI-TOFMS 技術和微生物質控品”等先進檢測技術應用于藥品微生物鑒定的技術瓶頸問題開展研究，建立系統(tǒng)、協(xié)同應用的藥品微生物鑒定關鍵技術體系，滿足精準鑒定、溯源調查以及風險評估等多場景應用需求。其次，針對測序技術和 MALDI-TOFMS 技術應用于藥品微生物鑒定,缺乏權威的結果判定標尺、數據庫和應用平臺問題，研發(fā)具有自主知識產權的微生物標準核酸序列及質譜特征蛋白圖譜信息“云數據庫”有效提升測序和質譜技術數字信息的使用效率,保護國家藥品數據安全。最后針對國內外整體缺乏體系化的藥品微生物核酸鑒定技術標準,無法保證核酸鑒定技術應用的規(guī)范性、科學性和適用性等問題,在國際上率先構建以藥典為核心的國家藥品微生物核酸鑒定技術通則標準體系,填補相關領域標準空白,體系化引領國際藥品微生物核酸鑒定技術標準的發(fā)展。中國藥典分子生物學技術標準體系的構建包括三個層面:第一層面是建立通用技術要求標準,如通則9108 和通則 9109:第二層面是建立應用于相關領城的檢測技術通則標準,如通則 1001、通則 1021 和通則 9204 等:第三層面是將上述標準拓展及應用于標準各論和實際的生產中。這三個層面的標準體系構建和持續(xù)推進也符合《中國藥典》2025 年版編制綱要的計劃和要求。
從微生物鑒定中獲得的信息對于調查產品或工藝的污染源非常重要。不同的微生物鑒定方法都有其優(yōu)勢和局限性,需要根據需求選擇最合適的方法以期達到最佳效果。伴隨成本的降低和分子生物學方法的不斷進步,分子生物學技術在藥品微生物鑒定源中的應用前景將會更加寬廣。未來,分子生物學技術將在藥品微生物快速檢測技術、多技術聯(lián)用等方面得到更廣泛的應用。目前,聚合酶鏈式反應和 16S rRNA 測序技術已納人《中國藥典》,其他分子生物學技術的標準化也將對藥品微生物的鑒定溯源提供更加全面、準確、可靠的判定結果,為企業(yè)的生產環(huán)境微生物負載控制和藥品的質量控制提供有力的技術保障。《中國藥典》分子生物學技術標準體系的持續(xù)構建實現了標準化引領,促進了醫(yī)藥產業(yè)高質量發(fā)展。未來將進一步完善分子生物學技術標準體系,為微生物精準鑒定、溯源分析和風險評估提供強有力的技術手段。
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