前言
有水就有生命，有水就有生化反應，水也是引起產(chǎn)品降解從而導致保質(zhì)期縮短的主要因素之一；
冷凍干燥是一個在很低的溫度下通過升華和解吸附的方式去除產(chǎn)品中水分的過程；
殘余水分和頂空殘氧量是兩個促進產(chǎn)品降解的常見因素，會引起產(chǎn)品的穩(wěn)定性變化從而導致產(chǎn)品保質(zhì)期不足；
冷凍干燥可以很好的同時解決這兩個問題；
藥物分子在凍干狀態(tài)下保持穩(wěn)定的機理是：形成了具有低分子流動性和低反應活性的高粘度無定形玻璃態(tài)；
玻璃態(tài)/無定形態(tài)的臨界點是玻璃轉(zhuǎn)化溫度（Tg）：將凍干產(chǎn)品暴露在高于其玻璃轉(zhuǎn)化溫度（Tg）的溫度下，粘稠的玻璃態(tài)將轉(zhuǎn)化為粘稠度較低的 "橡膠 "態(tài)（如圖一），其熱容量、分子流動性和反應性都會增加，從而穩(wěn)定性降低；
圖一：Tg、粘度、溫度之間的關(guān)系圖
凍干產(chǎn)品的溫度超過 Tg 值還會有反玻璃化的風險：即某些可結(jié)晶的輔料會發(fā)生結(jié)晶，從而進一步影響產(chǎn)品的穩(wěn)定性；
凍干產(chǎn)品的 Tg 值的確定對設計加速穩(wěn)定性研究非常重要。因為在高于 Tg 值的溫度下生成的加速穩(wěn)定性數(shù)據(jù)無法預測在較低儲存溫度下產(chǎn)品的行為，也不能由此來估計產(chǎn)品的保質(zhì)期；
建議在至少低于產(chǎn)品Tg 10℃的條件下，進行產(chǎn)品的穩(wěn)定性研究。
* Chang 等人報告說，當 IL-2 的儲存溫度高于其 Tg 值時，其脫氨率和聚集率更高；
Strickley等人報道，隨著儲存溫度的升高：接近或超過Tg值時，胰島素的聚集速率會增加，即使在玻璃狀態(tài)下也會發(fā)生脫酰胺；
其他研究小組報告顯示，Tg對酶活性的穩(wěn)定性沒有太大影響。
凍干粉餅的水分含量和Tg又有什么關(guān)系呢？
凍干粉餅的Tg隨著其水分含量的升高而降低：大概水分每增加1%，則產(chǎn)品的Tg降低10℃（此數(shù)據(jù)僅為一個大概的數(shù)據(jù)，用戶幫助大家理解Tg和粉餅水分之間的關(guān)系）
圖二紅色框內(nèi)部分也表達了兩者之間的關(guān)系：
圖二：冷凍干燥過程中的相圖
為了提高產(chǎn)品存儲的穩(wěn)定性，需要將凍干后產(chǎn)品的水分降到一個很低的數(shù)值；
對于每個產(chǎn)品來說，降低到多低的數(shù)值：小于＜2%、1%，還是3%？根據(jù)產(chǎn)品分子的不同，這個標準都會不同；
很多同學私信問我：凍干產(chǎn)品是否有一個統(tǒng)一的水分標準，是否是越低越好，還有同學說他們產(chǎn)品水分必須要達到0.5%以下才能保持穩(wěn)定性如何才能做到？
但很遺憾，這些問題都沒有辦法用一句話來回答，并不存在統(tǒng)一的標準答案；
對于每一種凍干產(chǎn)品：都需要通過系統(tǒng)的水分研究來評估殘余水分含量對產(chǎn)品質(zhì)量屬性的影響。這項研究的結(jié)果將為產(chǎn)品殘余水分標準的設計提供依據(jù)。
有兩種方法可以用于研究凍干產(chǎn)品的最終水分標準，本篇文章將會詳細介紹這兩種研究方法。
方法 一：水分吸附等溫線
為配方/產(chǎn)品最初建立的吸濕等溫線如圖 3 所示；
水分吸附等溫線將水活性（αw）與相應的凍干材料聯(lián)系起來，每種材料和溫度對應的等溫線都是唯一的；
圖三：25 °C 時蛋白質(zhì)配方的吸附等溫線
吸濕等溫線通常使用吸附微天平以重力法獲得；
要獲得吸濕等溫線，需要將初始干燥的樣品置于相對濕度（RH）不斷增加的環(huán)境中，通常最高可達 70% RH；
在每個水活度水平上，連續(xù)測量樣品的重量，直到觀察到平衡為止。
理論上，當樣品的重量隨時間保持不變時，平衡就建立了。不過，在實踐中，當樣品重量在預定時間內(nèi)的變化足夠小時，就可以認為樣品處于平衡狀態(tài)。
在較高的相對濕度下，配方中的某些成分/輔料可能會結(jié)晶，這一點可從水分的解吸中看出來；
某些輔料的結(jié)晶可通過偏光顯微鏡來確定，如圖 4 所示，回收的樣品會出現(xiàn)雙折射；
通過粉末X射線衍射可以確認結(jié)晶。
圖四：偏光顯微鏡觀察從吸附微天平上回收的樣品，顯示某些配方成分結(jié)晶 成分結(jié)晶可通過粉末 X 射線 衍射
水分平衡
一旦建立了吸附等溫線，就可以通過兩種方法來研究在不影響產(chǎn)品穩(wěn)定性的情況下，產(chǎn)品中可以殘留的最大水分含量；
一種方法是在不同的相對濕度下平衡凍干的蛋糕，以獲得不同水平的殘余水分含量；
不同的相對濕度可通過不同濃度的 NaOH 溶液（見表一）來實現(xiàn)；
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NaOH 溶液測得 |
R.H (%) |
預期含水量 |
測量的含水量 |
|
水分含量（%） |
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（%） |
|
|
（%） |
|
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濃度（摩爾） |
_ |
_ |
干燥 |
卡爾費休滴定法 |
|
|
|
失重法 |
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23.05 |
11 |
13 |
1.7 |
1.7 |
|
14.96 |
25 |
2.4 |
3,1 |
2,8 |
|
12.53 |
35 |
3.2 |
3.8 |
3.5 |
|
10.64 |
45 |
4.3 |
4.9 |
4.8 |
表一：氫氧化鈉鹽濃度可實現(xiàn)不同的濕度
或使用不同鹽類的飽和溶液來提供不同的相對濕度，如表二 所示；
|
鹽溶液 |
Control |
LiCI |
LiI |
MgCI2 |
Mg(NO3)2 |
|
% 相對濕度 (RH) |
N/A |
11 |
18 |
33 |
53 |
|
% 西林瓶中樣品水分 |
0.6 |
1.2 |
1.6 |
2,7 |
4.2 |
表二：環(huán)境相對濕度VS樣品水分
樣品在這些溶液中在真空條件下平衡一夜， 過夜平衡后的樣品含水是用干燥失重法法和卡爾費休滴定法測量，結(jié)果見表一。
這些不同的殘余含水量的樣品在加速（37 °C）條件下放置3 個月；
在建議的儲存條件下（2°C 至 8°C）放置 2-3 年；
根據(jù)這些數(shù)據(jù)，確定凍干產(chǎn)品的最終殘余水份指標，并在最終產(chǎn)品的放行實驗中執(zhí)行；
樣品準備
? 將裝有飽和鹽溶液的培養(yǎng)皿連同濕度計一起放入干燥器或手套箱中，讓其過夜平衡；
? 如果使用手套/干燥箱，則用氮氣吹掃干燥箱，直到相對濕度低于鹽溶液的預期水平；
? 將西林瓶放入干燥箱或手套箱中，在箱內(nèi)或干燥箱中打開膠塞并關(guān)閉干燥箱門；
? 在 t = 0、t = 24 小時和 t = 48 小時時取出樣品瓶，用卡爾費休法測定水分含量。
卡爾費休水分分析法
表 二 和圖 五 總結(jié)了卡爾費休法測量的暴露于不同相對濕度百分比后的含水量；
圖 五 平均殘余水分值與相對濕度百分比的關(guān)系
方法 二：凍干機在線取樣法
在凍干工藝運行過程中，不斷地取出樣品；
在這種方法中，當一次干燥達到終點的時候（當皮拉尼壓力計與電容壓力計（CM）的壓力趨于一致時），從不同位置用凍干機配備的在線取樣裝置取出西林瓶；
圖六：在線取樣時間段標示圖
一次干燥到二次干燥升溫的斜坡階段，二次干燥溫度保持階段每隔1-3小時，用在線取樣裝置從凍干機中取出西林瓶并在取樣之后壓塞；
圖七：凍干機上在線取樣裝置工作示意圖
圖八：取樣后進行壓蓋示意圖
圖九：在線取樣裝置實物圖
一次干燥結(jié)束后，一次干燥到二次干燥的升溫階段，二次干燥的溫度保持階段，樣品中的殘余水分不斷減少，如圖十：
圖十：在線取樣樣品水分變化示意圖
（初始水分根據(jù)產(chǎn)品的不同而不同，我示范的這個數(shù)據(jù)初始水分偏低不少）
不同時間段取出的樣品，殘余水份也都不同；
這些不同的殘余含水量的樣品在加速（37 °C）條件下放置3 個月；
在建議的儲存條件下（2°C 至 8°C）放置 2-3 年；
根據(jù)這些數(shù)據(jù)，確定凍干產(chǎn)品的最終殘余水份指標，并在最終產(chǎn)品的放行實驗中執(zhí)行；
注釋：
產(chǎn)品裝量規(guī)格
? 在選擇西林瓶膠塞和最終產(chǎn)品的裝量規(guī)格時必須謹慎；
? 需要注意當裝量減小或西林瓶和瓶塞尺寸增大時，在 2 年保質(zhì)期內(nèi)有可能出現(xiàn)凍干粉餅水份超標的情況；
? 西林瓶和膠塞的尺寸增大時，在 2 年保質(zhì)期內(nèi)殘余水份超標的風險就會大大增加；
? 當粉餅質(zhì)量減少時，殘余水份超過在2年保質(zhì)期內(nèi)超標的風險也會大大增加如表三；
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特征 |
產(chǎn)品A |
產(chǎn)品B |
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產(chǎn)品水分限度 |
2% |
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蛋糕重量 |
500mg |
50mg |
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膠塞重量 |
2.5gm |
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膠塞水分 |
0.2% = 5 mg |
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潛在產(chǎn)品水分 |
1% |
10% |
表三 減少灌裝干物質(zhì)質(zhì)量導致水分指標不合格的風險說明
*膠塞水分遷移是影響產(chǎn)品水分的一個重要因素，此篇主要講凍干產(chǎn)品水分指標的確定方法，膠塞水分遷移的原理和解決方案以后再單獨開一篇來講吧。
最后的話
凍干產(chǎn)品的最終水分沒有一個統(tǒng)一的標準；
每個產(chǎn)品用一套確定水分標準的研究方法來確定一個這個產(chǎn)品需要符合的水分放行標準；
在實踐中，我們看見有些產(chǎn)品的水分合格標準是低于2%、有些是低于1%，有些將3%作為放行標準也完全沒問題。關(guān)鍵是你對于這個問題進行過系統(tǒng)的研究，有足夠的數(shù)據(jù)作為支持；
實踐中大家的水分標準常常是從同類產(chǎn)品的標準“借鑒“來的，有些同學因為這個問題收到了來自監(jiān)管部門的“挑戰(zhàn)”；
如果在制定標準的過程中，遵循科學的方法，積累了足夠的數(shù)據(jù)，這個“挑戰(zhàn)”可能更可以是一個證明我們研究過程嚴謹?shù)?ldquo;機會”；
參考文獻：
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2. Pikal MJ. Mechanisms of protein stabilization during freeze drying and storage: the relative importance of thermodynamic stabilization and glassy state relaxation dynamics. In: Rey L, May J, editors. Freeze drying/lyophilization of pharmaceutical freeze drying 1831d biological products. Marcel, Dekker, Inc.; 1993. 2. Carpenter JR,
3. Pikal MJ, Rigsbee D, Roy ML, Galreath D, Kovach KJ, Wang W, Carpenter JF, Cicerone MT. Solid state chemistry of proteins: II. The correlation of storage stability of freeze-dried human growth hormone (hGH) with structure and dynamics in the glassy solid. J Pharm Sci. 2008;97(12):5106–21.
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