膜是器官芯片(OOC)平臺的基本元素，因為它們為貼壁細胞提供支持，允許營養物質(和其他相關分子)通過膜孔滲透/交換，并實現機械或化學刺激的傳遞。通過OOC平臺，生理過程可以在體外研究，而OOC膜拓寬了機械和化學線索如何影響細胞和器官的知識。帶膜的OOC是體外微流控模型，用于各種應用如藥物研發和疾病建模，或用于替代動物試驗。
來自墨西哥蒙特雷理工學院的Sergio O. Martínez-Chapa、Mohammad Mahdi Aeinehvand綜述了OOCs與膜的相關性，以及它們在不同器官模型中的支架和驅動作用、性質(物理和材料)和制造方法。相關論文“Polymeric and biological membranes for organ-on-a-chip devices”于2023年8月29日發表于雜志《Microsystems & Nanoengineering》上。
首先描述了液體流動和循環應變的機械刺激，以及它們對細胞產生的生理相關性(IPR)的影響；
其次，還包括合成和ECM(細胞外基質)蛋白膜的制備方法、它們的特性(例如，厚度和孔隙率可以根據應用進行調整)，以及用于其涂層的生物材料；
最后，討論并描述了膜在不同研究目的中的作用及其優勢和挑戰。
1. 提高細胞生理相關性的相關力學條件
剪切力以及化學和機械信號不僅對細胞存活至關重要，而且還影響細胞活動，如細胞遷移、通過離子通道的質量傳輸和蛋白質構象變化。如圖1所示，OOCs中生理流動和機械應力的實現和組合對于闡明細胞相互作用及其對微環境的反應至關重要，這與病理學研究越來越相關，因為更現實的生理環境(例如，全血灌流)能夠實現更多的生理反應(例如，患者來源的細胞培養)。在以上方面，OOC上的膜作為支撐物、屏障或減震器間接調節細胞暴露于外力(剪切力、流體流動、機械刺激)。這一部分綜述了聚合物膜對OOCs的研究，其中討論了流體切應力和機械驅動在不同組織培養中的影響。
圖1 膜介導細胞在流體剪切應力和機械驅動下的機械感應
（1）OOCs中的流體剪切應力
流體剪切應力(FSS)通過血液流動直接存在于體內，在代謝物去除和觸發表型變化中發揮關鍵作用。在許多OOC中，連續的流體流動會去除代謝物，限制了與細胞的相互作用和攝取。盡管不利于藥物暴露研究，但這一特征導致抑制因子的去除，從而有助于細胞的生理相關性(IPR)、基因表達和細胞性能的提高。反過來，細胞IPR(例如，通過屏障功能所需的緊密連接)有助于限制成熟細胞中的物質通透性。多孔膜會影響OOC內的液體流動。Chung等人的研究基于膜的厚度和孔隙度計算了滲透率和流速分布。結果表明，從溶質擴散、流體流動和電流方面表征組織屏障的滲透性可以指導組織屏障和共培養模型的設計和評估。溶質通透性是組織屏障緊密性和主動運輸速率的指標，可以通過示蹤分子的通透性來估計。另一方面，流體滲透性表明屏障形成成熟，組織屏障的一般漏性可以通過經上皮/經內皮電阻(TEER)快速評估。因此，FSS在OOC內創造了一個動態的微環境，與多孔膜等元素相互作用，使細胞更接近于器官水平的結構和功能。
（2）創造一個動態的環境來促進細胞的特化
剪應力的相關性可以追溯到它對細胞機制的影響，細胞機制感知并響應外部變化。例如，腦微血管內皮細胞對FSS(例如，毛細血管樣剪應力~6dynes/cm2)的反應是通過增加細胞骨架蛋白的產生以及緊密連接和轉運蛋白來實現的。在腎臟，FSS(0.2-5dynes/cm2)有助于F-肌動蛋白的聚合和解聚，從而影響腎小管的形態和極化。FSS(0.002-0.03dynes/cm2)影響腸上皮細胞(如Caco-2細胞)的微絨毛形成和機械轉導。
剪切力通過刺激機械感應蛋白F-肌動蛋白和絨毛蛋白，導致上皮刷狀邊界重組，這是腸道功能的基礎。如圖2a所示，Caco-2細胞的緊密連接在中等FSS(0.02dyn/cm2)時形成，但在低FSS(0.002 dyn/cm2)和高FSS(0.03dyn/cm2)時減少。高水平的FSS增加了空泡化(一種細胞應激指標)，保護性粘液的產生，以及線粒體的活性，這是由于對ATP屏障完整性的依賴。FSS與細胞內和細胞外刺激一起影響細胞特化，最終使FSS感應產生反饋循環。
（3）應用FSS技術研究細胞體外分化機制
當使用OOC時，細胞暴露在FSS中，通常使用膜來提供支持，并通過毛孔實現營養擴散。Shin等人進行了一項研究，以闡明基底液和頂部液剪切力對培養在芯片上的腸道上皮細胞的影響。研究人員收集了在靜態Transwell中培養三天的Caco-2細胞的培養液，并將樣本流過芯片上腸管的底腔，同時保持頂腔上持續的液體流動，導致培養在芯片上的腸道中的Caco-2細胞的3D形態發生停止。此外，作者將一個三周的Caco-2單層膜轉移到由有機硅創建的混合流體設備中(圖2b，c)，僅對底部腔施加液體流動，在48小時內觀察到三維形態發生。
圖2 微流控裝置中流體流動的相關性
（4）利用FSS更接近地模擬器官水平的功能
在這些研究中，模擬了多層器官，并通過同時接觸流體或FSS使膜兩側的細胞層分化。在OOCs中，細胞暴露于外部機械信號，如FSS和應力/應變，可以被調節以產生不同的特化特征，而膜可以使小室和細胞層之間的通信并提供支持，進一步培育動態的封閉微環境。
2. 膜機械驅動
通過循環運動對膜的機械刺激在生理上與經歷呼吸的肺細胞、經歷蠕動運動的腸細胞或跳動的心臟細胞有關。機械刺激通常是通過膜兩側的一對側室的真空吸(圖3)或通過電產生的負壓來實現的。
圖3 OOC機械驅動
機械驅動也被證明影響細胞排列，這可能是由應變避免機制或存在或不存在約束邊界條件(拉伸或約束)驅動的。在內皮細胞、成纖維細胞、間充質干細胞和成骨細胞中均存在應變避免或垂直于施加的循環拉伸的方向。最后，除了支持和驅動外，OOC中的膜還可以保護組織免受非生理性剪切力的不利影響。例如，當使用離心將hiPSC(人類誘導多能干細胞)衍生的心肌細胞裝入芯片時，膜限制了介質模塊中的對流運輸，而位于組織腔室的細胞保持活力和功能。
OOC中的FSS和機械驅動
復雜的機械條件，如FSS和機械刺激的結合，導致器官水平的結構和功能的產生，更接近于在體內觀察到的結構和功能，從而允許重述復雜的機制。另一個例子是血管，由于跨壁壓力和血液流動摩擦產生的壁切應力，血管在體內經歷周期性應變。跨壁壓力導致血管壁擴張(向各個方向變形)并改變剪應力，而剪應力在血流方向上起作用，這兩種力量都能誘導內皮細胞發芽并增加屏障功能。
3. 膜特性
細胞可以感知環境的變化，包括影響其黏附、形態、生長、交流和遷移過程的機械和化學變化/線索。要實現這種靈敏度，必須精確控制膜的特性，如硬度。硬度可以通過成分變化、表面形貌和厚度來調整，這可以通過微米和納米軟化來實現。用于開發用作細胞培養支架的膜的主要參數如圖4所示。
圖4 膜的特性可以調整來模擬體內表面和促進細胞特化
（1）硬度
基底硬度產生與ECM和粘附蛋白相關的不同基因表達模式，從而影響細胞活性。例如，當在堅硬的表面上培養時，人間充質干細胞(hMSCs)更容易擴散，表現出更穩定的局灶粘附，并表現出更快的遷移和更高的增殖率。模擬大腦的軟基質是神經源性的，而更硬的、類似肌肉的支架是肌源性的，而堅硬的膠原基質是成骨性的。
（2）形貌
膜的形貌特征包括多孔，孔狀結構可以促進組織的粘附和聚集。例如，孔隙度使細胞遷移并增加表面積。膜的表面結構可以是凸起或凹陷的，并根據幾何形狀或纖維影響接觸引導細胞。可以通過納米球、微柱或提供錨點的納米顆粒對表面進行修飾，暴露于FSS的細胞對具有凹槽形貌的膜表面具有更高的粘附性，因為它們與天然ECM相似。
（3）厚度
膜厚度影響細胞通訊、接觸，甚至影響組織結構。商用膜和許多復制品模制的PDMS膜的厚度約為10μm，這阻礙了所需的凸起和通過孔的細胞類型之間的并置。體內肺泡膜厚度為2.2 μm，胎盤厚度為4.53 μm，血管基膜厚度小于100 nm。
4. 合成聚合物膜的制造
（1）PDMS膜的制備方法
PDMS除了具有高彈性、光學透明性和生物相容性外，還具有高機械穩定性、低化學反應性和低導熱性，是一種彈性體和標準材料。然而，PDMS的組成和固有剛度與天然ECM有很大不同，影響了細胞的生長和粘附。此外，PDMS的疏水性阻礙了生物分子的附著和蛋白質的吸附。
PDMS膜是一種多功能且有前途的OOCs元件，膜制造技術的最新發展為人體生理和疾病的體外研究創造了新的途徑。然而，傳統的PDMS微流控器件制造技術，包括軟光刻技術，可能存在諸如高成本和有限的可擴展性等缺點。因此，為了克服這些限制，正在開發新的制造技術，包括靜電紡絲、表面改性、增材制造和模板。
軟光刻技術
亞微米特征是細胞培養的關鍵，因為它們允許細胞間交流和物理接觸，而薄膜提高生物分子運輸和營養物質轉移率。由于傳統光刻的衍射限制(圖5，左)，很難生產孔徑和厚度小于5 μm的PDMS膜。用于制造硅模具的高分辨率光掩模(<2 μm)是可用的，但價格昂貴。無掩模激光直寫技術提供了克服這一限制的替代解決方案，并提供了關于微米級圖案設計和3D幾何的靈活性。聚乙烯醇(PVA)被用作PDMS結構的犧牲層。Pensabene及其合作者提出了一種制造犧牲PVA納米針的方法，以制造用于人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)培養的聚L -乳酸(PLLA)膜。該方法使用飛秒激光加工形成具有1 μm直徑孔的硅晶片，然后涂上稱為Partall®Film #10的水/醇基PVA脫模劑(圖5，右)。
圖5 多孔膜的制作過程可分為以下幾個主要步驟：模具制作、減少附著的處理和膜制作
高壓飽和蒸汽形成孔隙
Jang和他的合作者通過高壓滅菌循環探索了高壓飽和蒸汽的孔隙形成。該方法結合溫度、壓力和濕度，產生微米級氣泡，一旦PDMS固化，這些氣泡就會變成孔隙(圖6)。該工藝減少了膜的厚度，從而增強了膜的物理性能，增加了楊氏模量、粗糙度和透氣性。
圖6 Jang等(2019)提出的高壓飽和蒸汽法制備多孔PDMS膜
替代方法:3D打印、靜電紡絲等
替代技術包括PDMS 3D打印和使用多孔素(如鹽和糖等可溶解顆粒)和用于微圖案的顆粒(玻璃微球)。Ozbolat及其合作者進行的一項研究發現，與鑄造樣品相比，PDMS 3D打印改善了其機械性能(圖7)。
圖7 PDMS 3D打印改善了由于表面不均勻而導致的細胞粘附和擴散
（2）蛋白質和水凝膠膜涂層
本節介紹用于增強合成膜生物相容性或促進細胞與底物相互作用的主要生物材料。重點放在普遍實施和良好表征的生物材料，如膠原蛋白，纖維連接蛋白和水凝膠。
OOC膜涂層中的蛋白質
膠原蛋白和纖維連接蛋白是體外模擬細胞外基質的兩種主要蛋白質。Matrigel®是一種基于細胞外基質的鼠源性水凝膠，由于其類似于上皮基底膜，因此是一種廣泛使用的基質。蛋白質可以作為單層或局部以特定形狀或圖案被覆在膜上。選擇性轉移通過微接觸打印(μCP)或微流體實現，并提供細胞(例如，心臟組織或肌肉纖維)通過改變方向和排列對其作出反應的幾何線索。μCP蛋白質圖案的大小可以低至0.5μm；然而，圖案的完整性取決于膜的特征大小和化學性質，因為更大的特征和疏水表面呈現更強大的結合。Wright和他的合作者進行的一項研究使用可重復使用的10 μm厚的對二甲苯-C模板在PDMS和聚苯乙烯上實現了纖維連接蛋白圖案(圖8)。
圖8 蛋白質與細胞構型
OOC膜涂層用水凝膠
水凝膠有效地模擬了ECM的化學成分和機械性能127，因此可以生物物理地刺激細胞分化和排列。水凝膠可以通過光刻和微圖像化、立體光刻、微成型、微流體粘指法和生物打印等方法進行微制造。刺激響應水凝膠可以通過pH值、溫度、離子強度和電場或磁場來驅動或定型。如聚(N-異丙基丙烯酰胺)(PIPAAm)是一種熱響應性水凝膠，由于其較低的臨界溶液溫度(LCST)，它可以開關其溶解度和聚集性；海藻酸、殼聚糖和透明質酸（HA）等天然水凝膠具有生物相容性，例如，HA 具有CD44受體，當與細胞結合時可產生細胞粘附力；半合成水凝膠，如甲基丙烯酰化明膠（GelMA），含有天然和合成成分。明膠是膠原蛋白水解的產物，含有細胞粘附序列，如 RGD 和基質金屬蛋白酶，細胞可通過這些序列粘附、增殖和擴增。
5. 生物ECM蛋白膜
細胞外基質在結構上可分為兩部分，一部分是致密多孔的基底膜，由膠原蛋白 IV、纖連蛋白和層粘連蛋白等蛋白質組成；另一部分是致密的親水性間質，由蛋白聚糖和纖維狀（I 型）膠原組成。整合素是一種跨膜蛋白，可傳遞外部信號并經歷構象變化。整合素與ECM蛋白(膠原蛋白、纖維連接蛋白、層粘連蛋白)相互作用，并通過與細胞骨架的連接影響細胞形狀。一種實現原位制造的血腦屏障(BBB)芯片利用微流體實現了臨時殼聚糖膜，膜作為星形膠質細胞的支撐，一旦星形膠質細胞培養建立，去除膜，與星形膠質細胞直接接觸的內皮細胞共培養(圖9e)。利用殼聚糖的pH響應性，通過界面聚合制備膜。碳酸鹽(中性，pH 7.0)和磷酸鹽(堿性，pH 9.6)緩沖液在微流控裝置上共流動(圖9b)。殼聚糖膜在緩沖液之間的界面之間形成，注入碳酸鹽與殼聚糖接觸，碳酸鹽使殼聚糖質子化并使其可溶。然后，殼聚糖接觸堿性磷酸鹽緩沖液時，通過去質子化發生聚合。在膜的一側植入星形膠質細胞后，通過醋酸溶液(pH 5.0)通過質子化去除殼聚糖(圖9c, d)。
圖9 Tibbe等人(2018)原位殼聚糖膜制備
綜上，OOC中的膜有助于提供與細胞在體內所經歷的環境非常相似的環境，這些環境涉及機械因素，特別是剪切應力和機械拉伸，或固有的材料特性，如剛度和形貌。本文綜述了不同膜的主要特性、作用和材料。PDMS是拉伸應用和基因表達研究的首選材料，但通常需要蛋白質涂層，含有蛋白質的ECM膜可以長時間支持細胞生長并誘導更多的生理反應。最佳的膜應該由足夠薄的天然蛋白質組成，以使細胞通信和/或接觸，而不犧牲機械刺激所需的靈活性。
文章來源：https://doi.org/10.1038/s41378-023-00579-z
