對于柱長為50~250mm，內(nèi)徑為4~5mm進(jìn)行的分離，樣品中單個(gè)化合物的量應(yīng)該≤50μg，樣品的進(jìn)樣體積也應(yīng)≤25μL（當(dāng)把流動(dòng)相用作進(jìn)樣的溶劑）。
對于內(nèi)徑比較小的柱子，樣品大小應(yīng)該減少至與柱子直徑的平方成正比。如果樣品中包含可電離的分子，樣品量＞1μg就會(huì)出現(xiàn)柱子超載的現(xiàn)象。
為了避免由于樣品進(jìn)樣量太大，而在分離中出現(xiàn)不想要的變化；
為了增加痕量分析中檢測器的敏感度需要使用盡可能大的樣品進(jìn)樣量；
為了在制備HPLC中最大化回收凈化后的產(chǎn)品量。
由于樣品的進(jìn)樣體積或進(jìn)樣量太大而造成的分離度和（或）保留時(shí)間的變化，分別稱為體積超載和質(zhì)量超載。
體積超載：樣品體積對分離效果的影響。
假設(shè)樣品中的分子濃度保持不變，樣品體積對峰的尺寸和形狀的影響如下圖所示，隨著樣品的進(jìn)樣體積按照進(jìn)樣順序1~4不斷增加，色譜峰開始逐漸加寬，然后形成一個(gè)平扁的頂部。
幾種不同的色譜柱構(gòu)造，它們的最大樣品進(jìn)樣體積如下：
(150mmx4.6mm，3μm顆粒）Vs≤80μL
(100mmx4.6mm，3μm顆粒）Vs≤50μL
(30mmx4.6mm，3μm顆粒）Vs≤30μL
(30mmx2.1mm，1.5μm顆粒）Vs≤4μL。
如果色譜圖中較早洗脫出來的峰的分離度并不是關(guān)鍵，那么就可以進(jìn)樣較大體積的樣品。
樣品可能溶解在某種溶劑的溶液中而不是在流動(dòng)相里。當(dāng)樣品溶劑比流動(dòng)相要弱時(shí)，可以進(jìn)樣體積較大的樣品而不會(huì)對峰寬和分離度造成負(fù)面影響。相反，進(jìn)樣溶解在比流動(dòng)相強(qiáng)的溶劑里的樣品，往往會(huì)使得色譜圖中較早洗脫出來的色譜峰發(fā)生譜帶加寬和（或）扭曲變形。用比流動(dòng)相強(qiáng)的溶劑來配備樣品是一種常見的錯(cuò)誤， 如果有可能應(yīng)該盡量避免。如果不方便更換樣品溶劑，那么雖然樣品溶解在較強(qiáng)的溶劑里， 但是只要進(jìn)樣體積夠小，色譜圖就不會(huì)受到影響（可以忍受）。
以1:1的比例用較弱的A溶劑（比如水）稀釋樣品，然后以2倍的體積進(jìn)樣。這樣做能有效地減少樣品溶劑帶來的問題（尤其是當(dāng)一個(gè)樣品溶劑＞50%B) ，而同時(shí)也能保持進(jìn)樣的樣品量不變。較大的進(jìn)樣體積和較強(qiáng)的樣品溶劑可以在梯度洗脫法里使用，因?yàn)樵谔荻认疵撻_始的時(shí)候樣品會(huì)和較弱的流動(dòng)相（較低的％B ）混合。如果有疑問，那么將進(jìn)樣體積減小為原來的一半以及增加為原來的2 倍，并且觀察不同的進(jìn)樣體積對分離度的影響，接著再根據(jù)相應(yīng)的情況作進(jìn)一步調(diào)整。
質(zhì)量超載：樣品重量對分離效果的影響。
即便樣品的進(jìn)樣體積較小，溶解樣品的質(zhì)量也會(huì)有可能導(dǎo)致色譜柱超載，造成樣品峰的加寬和變形。這種情況的發(fā)生是因?yàn)橹颖Ａ魳悠贩肿拥娜萘渴怯邢薜模灰簿褪钦f靠近峰帶的固定相中樣品飽和。下圖顯示的是一個(gè)由于柱子超載而造成的譜帶加寬的例子。樣品進(jìn)樣量的大小順序?yàn)?a<1b<1c<1d<2<3<4（最大進(jìn)樣量）。
只要樣品中各個(gè)成分的重量不要過多（ 通常對于4.6mm內(nèi)徑的柱子進(jìn)樣量<50μg ，內(nèi)徑小的柱子，進(jìn)樣量也相應(yīng)要減少），每個(gè)峰帶在柱子內(nèi)的移動(dòng)就不會(huì)受到樣品中其他峰帶的影響。因此，樣品中單個(gè)化合物的重量，往往決定了色譜柱是否會(huì)超載，峰形是否會(huì)發(fā)生改變，而與樣品總重量無關(guān)。其中一個(gè)化合物引起色譜柱的超載，也不會(huì)影響到樣品中其他色譜峰的分離（只要它們都是基線分離的）。只有當(dāng)單個(gè)化合物的進(jìn)樣量太大，才會(huì)發(fā)生色譜柱超載的現(xiàn)象并同時(shí)出現(xiàn)色譜峰的拖尾（ 比如對于內(nèi)徑為4.6mm 的柱子進(jìn)樣量＞50μg)。
01避免進(jìn)樣過多所引起的問題
以常規(guī)的HPLC分離實(shí)驗(yàn)執(zhí)行樣品分析的時(shí)候，針對同樣的分離程序，最好能保證不同化合物的k、N和Rs值保持不變。這個(gè)要求簡化了基于保留時(shí)間的定量分析和色譜峰的識(shí)別。要保持k、N和Rs的值不變，就必須保證樣品的進(jìn)樣量足夠小，以避免柱子超載，并且分離效果也就不會(huì)隨著樣品進(jìn)樣量大小而變化，通常需要樣品量和體積都不超過一定的界限。樣品體積一般在HPLC實(shí)驗(yàn)里是保持不變的，主要擔(dān)憂的是樣品中的分析物濃度過高。再次，Wmax的值應(yīng)該是指樣品中各個(gè)化合物的重量， 而不是樣品的總重量。舉例說，如果樣品中沒有一個(gè)成分超過樣品總量的10% ，那么與僅僅含有單個(gè)成分的樣品相比，此樣品的最大樣品進(jìn)樣量就可以多10倍。
02 比預(yù)想的樣品濃度要高
如果一個(gè)分析物在不同樣品中的濃度不同，那么質(zhì)量超載就可能會(huì)由于樣品濃度過高而發(fā)生，造成分離度丟失，保留時(shí)間改變。分析物的濃度或重量對分離結(jié)果造成的這種影響，應(yīng)該在最后的HPLC 程序中都要考慮到（在方法建立之后）；樣品的最大進(jìn)樣濃度或者最大進(jìn)樣重量Wmax應(yīng)該早早確定，這樣就能避免因?yàn)闃悠烦d引起的問題，包括檢測器的超載，引起非線性的檢查結(jié)果。超過這個(gè)濃度的樣品就要再次稀釋或者重新分析。
03 痕量分析
在痕量分析中，最好能把峰高最大化，從而增加信噪比。通常被進(jìn)樣的痕量分析物的量都非常小，因此不會(huì)造成色譜柱超載的問題，但是樣品中的其他成分卻可能會(huì)引起色譜柱超載，可能會(huì)對分析物的分離效果造成潛在的負(fù)面影響。也就是說一個(gè)化合物的進(jìn)樣量如果過大，則可能會(huì)影響鄰近的另一個(gè)色譜峰譜帶的分離效果。
如果樣品中包含過多干擾性的化合物，在展開HPLC分離實(shí)驗(yàn)前最好就是能把樣品清潔一遍，除去干擾的化合物。在痕量分析中，進(jìn)樣最大可能的樣品體積是有利的。當(dāng)感興趣的色譜峰和鄰近的峰分離非常好并且也有足夠的樣品可以使用的話，增加樣品的進(jìn)樣體積有助于一步增加峰高。如果溶解樣品的溶劑遠(yuǎn)比流動(dòng)相弱，那么我們就可以使用較大的進(jìn)樣體積，并且色譜峰的大小也能保持與進(jìn)樣體積成正比，而不會(huì)出現(xiàn)額外的譜帶加寬的問題（這個(gè)方法尤其在梯度洗脫的時(shí)候會(huì)常用到）。這種增加檢測器靈敏度的方法是以充足的樣品量為前提的。
