蛋白質的分離純化在生物化學研究應用中使用廣泛，是一項重要的操作技術。蛋白質從其他蛋白質和非蛋白質分子中純化出來，是非常復雜的過程，有哪些坑，跟小編一起來看看吧。

蛋白純化原則

蛋白純化要利用不同蛋白間內在的相似性與差異，利用各種蛋白間的相似性來除去非蛋白物質的污染，而利用各蛋白質的差異將目的蛋白從其他蛋白中純化出來。每種蛋白間的大小、形狀、電荷、疏水性、溶解度和生物學活性都會有差異，利用這些差異可將蛋白從混合物如大腸桿菌裂解物中提取出來得到重組蛋白。

蛋白的純化大致分為粗分離階段和精細純化階段二個階段。一般蛋白純化采用的方法為樹脂法。粗分離階段主要將目的蛋白和其他細胞成分如DNA、RNA等分開，由于此時樣本體積大、成分雜，要求所用的樹脂高容量、高流速、顆粒大、粒徑分布寬，并可以迅速將蛋白與污染物分開，必要時可加入相應的保護劑（例如蛋白酶抑制劑），防止目的蛋白被降解。

精細純化階段則需要更高的分辨率，此階段是要把目的蛋白與那些分子量大小及理化性質接近的蛋白區分開來，要用更小的樹脂顆粒以提高分辨率，常用離子交換柱和疏水柱，應用時要綜合考慮樹脂的選擇性和柱效兩個因素。選擇性指樹脂與目的蛋白結合的特異性，柱效則是指各蛋白成分逐個從樹脂上集中洗脫的能力，洗脫峰越窄，柱效越好。僅有好的選擇性，洗脫峰太寬，蛋白照樣不能有效分離。

程序

分離純化某一特定蛋白質的一般程序可以分為前處理、粗分級、細分級三步。

前處理

分離純化某種蛋白質，首先要把蛋白質從原來的組織或細胞中以溶解的狀態釋放出來并保持原來的天然狀態，不丟失生物活性。為此，動物材料應先剔除結締組織和脂肪組織，種子材料應先去殼甚至去種皮以免受單寧等物質的污染，油料種子最好先用低沸點的有機溶劑如乙醚等脫脂。然后根據不同的情況，選擇適當的方法，將組織和細胞破碎。動物組織和細胞可用電動搗碎機或勻漿機破碎或用超聲波處理破碎。植物組織和細胞由于具有纖維素、半纖維素和果膠等物質組成的細胞壁，一般需要用石英砂或玻璃粉和適當的提取液一起研磨的方法或用纖維素酶處理也能達到目的。細菌細胞的破碎比較麻煩，因為整個細菌細胞壁的骨架實際上是一個借共價鍵連接而成的肽聚糖囊狀大分子，非常堅韌。破碎細菌細胞壁的常用方法有超聲波破碎，與砂研磨、高壓擠壓或溶菌酶處理等。組織和細胞破碎后，選擇適當的緩沖液把所要的蛋白提取出來。細胞碎片等不溶物用離心或過濾的方法除去。

如果所要的蛋白主要集中在某一細胞組分，如細胞核、染色體、核糖體或可溶性細胞質等，則可利用差速離心的方法將它們分開，收集該細胞組分作為下步純化的材料。如果碰上所要蛋白是與細胞膜或膜質細胞器結合的，則必須利用超聲波或去污劑使膜結構解聚，然后用適當介質提取。

粗分離

當蛋白質提取液（有時還雜有核酸、多糖之類）獲得后，選用一套適當的方法，將所要的蛋白與其他雜蛋白分離開來。一般這一步的分離用鹽析、等電點沉淀和有機溶劑分級分離等方法。這些方法的特點是簡便、處理量大，既能除去大量雜質，又能濃縮蛋白溶液。有些蛋白提取液體積較大，又不適于用沉淀或鹽析法濃縮，則可采用超過濾、凝膠過濾、冷凍真空干燥或其他方法進行濃縮。

細分離

樣品經粗分級分離以后，一般體積較小，雜蛋白大部分已被除去。進一步純化，一般使用層析法包括凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析以及親和層析等。必要時還可選擇電泳法，包括區帶電泳、等電點聚焦等作為最后的純化步驟。用于細分級分離的方法一般規模較小，但分辨率很高。

結晶是蛋白質分離純化的最后步驟。盡管結晶過程并不能保證蛋白一定是均一的，但是只有某種蛋白在溶液中數量上占有優勢時才能形成結晶。結晶過程本身也伴隨著一定程度的純化，而重結晶又可除去少量夾雜的蛋白。由于結晶過程中從未發現過變性蛋白，因此蛋白的結晶不僅是純度的一個標志，也是斷定制品處于天然狀態的有力指標。

離子層析法

當被分離的蛋白質溶液流經離子交換層析柱時，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質被吸附在離子交換劑上，隨后用改變pH等辦法將吸附的蛋白質洗脫下來。

有機溶劑提取

蛋白質純化有機溶劑提取的原理是：與水互溶的有機溶劑(如甲醇、乙醇)能使一些蛋白質在水中的溶解度顯著降低；而且在一定溫度、pH值和離子強度下,引起蛋白質沉淀的有機溶劑的濃度不同，因此，控制有機溶劑的濃度可以分離純化蛋白質。

例如,在冰浴中磁力攪拌下,在4℃預冷的培養液中緩慢加入乙醇(-25℃),可以使冰核蛋白析出,從而純化冰核蛋白。由于在室溫下,有機溶劑不僅能引起蛋白質的沉淀，而且伴隨著變性。因此,通常要將有機溶劑冷卻,然后在不斷攪拌下加入有機溶劑防止局部濃度過高,蛋白質變性問題就可以很大程度上得到解決。對于一些和脂質結合比較牢固或分子中極性側鏈較多、不溶于水的蛋白質,可以用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑提取,它們有一定的親水性和較強的親脂性,是理想的提取液。冷乙醇分離法提取免疫球蛋白最早由Cohn于1949年提出,用于制備丙種球蛋白。冷乙醇法也是WHO規程和中國生物制品規程推薦的方法,不僅分辨率高、提純效果好、可同時分離多種成分,而且有抑菌、清除和滅病毒的作用。

避坑指南

樣品中的 DNA/RNA 等核酸雜質污染難以去除？

a. 延長超聲時間以降低粘度。也可以使用核酸酶如 Benzonase 同時消化 DNA 和 RNA。如果來源是大腸桿菌裂解液，含有大量的 DNA，可以用鏈霉素沉淀等方法，預先去除大量的 DNA。

b. 通過層析方法去除：由于核酸帶負電，在陰離子柱上會結合或陽離子柱上流穿，也可有效去除核酸。

蛋白老也不掛柱？

a. 超聲功率不恰當：過大使得蛋白碳化，過小蛋白沒有釋放。建議調整超聲功率或超聲前添加溶菌酶增加細胞破碎率。

b. 緩沖液條件不合適：緩沖液中 EDTA、檸檬酸等金屬離子螯合劑濃度不能過高，也可以適當提高 pH。

c. His 標簽未充分暴露：在蛋白中加入適量的尿素或鹽酸胍等變性劑純化或上游分子水平改變 His 的長度或位置使其暴露在蛋白表面。

d. His 標簽未充分暴露：在蛋白中加入適量的尿素或鹽酸胍等變性劑純化或上游分子水平改變 His 的長度或位置使其暴露在蛋白表面。

e. 柱子過載：更換大體積柱子或多柱串聯。

蛋白掛柱后洗脫不下來？

a. 洗脫條件太溫和：增加緩沖液中咪唑濃度或者適當降低緩沖液 pH。

b. 非特異性的疏水或者其他相互作用：加入非離子去污劑或者增加 NaCl 的濃度。

c. 蛋白沉淀：適當降低上樣量或蛋白濃度，用咪唑線性洗脫；使用添加劑或者改變 NaCl 的濃度，或者在變性的條件下洗脫。

蛋白洗脫后雜質好多？

a. 蛋白酶降解部分目的蛋白：添加蛋白酶抑制劑改進

b. 雜蛋白與洗脫柱親和力高：優化咪唑濃度或改善 pH、NaCl 濃度

c. 雜質蛋白與目的蛋白相互作用：超聲前加入去垢劑或還原劑減少非特異性作用

隨著分子生物學、結構生物學、基因組學等研究的不斷深入，人們意識到僅僅依靠基因組的序列分析來試圖闡明生命活動的現象和本質是遠遠不夠的。只有從蛋白質組學的角度對所有蛋白質的總和進行研究，才能更科學地掌握生命現象和活動規律，更完善地揭示生命的本質。