為驗證蒸汽滅菌器的滅菌效果——我們設計了對照實驗：實驗組生物指示劑和待滅菌物品在121℃下滅菌15?min，對照組生物指示劑沒有進行滅菌處理。然后，將實驗組生物指示劑和對照組生物指示劑放在60℃培養箱中分別培養48?h后，發現實驗組安瓿的內容物呈紫紅色且澄清；對照組安瓿的內容物呈橘黃色且渾濁。這證明蒸汽滅菌器的滅菌過程有效，可殺滅孢子菌。

《藥品生產質量管理規范（2010年修訂）》中將驗證定義為：證明任何操作規程（或方法)、生產工藝或系統能夠達到預期結果的一系列活動［1］。并提到企業的廠房、設施、設備和檢驗儀器應當經過確認，應當采用經過驗證的生產工藝、操作規程和檢驗方法進行生產、操作和檢驗，并保持持續的驗證狀態［1］。

《中華人民共和國藥典（2020年版 四部）》中將生物指示劑定義為：一種對特定滅菌程序有確定及穩定耐受性的特殊活微生物制成品［2］。并提到濕熱滅菌121℃的生物指示劑通常選擇嗜熱脂肪地芽孢桿菌，且芽孢數范圍在1.0×105～5.0×106，D值為1.5～3?min，存活時間在4.5～14?min，殺滅時間在13.5～32.0?min。

《中華人民共和國藥典（2020年版 四部）》中將濕熱滅菌法定義為：將物品置于滅菌設備內利用飽和蒸汽、蒸汽-空氣混合物、蒸汽-空氣-水混合物、過熱水等手段使微生物菌體中的蛋白質、核酸發生變性而殺滅微生物的方法［3］。

1實驗目的

為了驗證微生物檢驗過程中所用物品經滅菌后能否達到無菌狀態，本實驗以公司化驗室的蒸汽滅菌器能否殺滅孢子菌為判斷依據進行實驗。首先，將生物指示劑和待滅菌物品一同置于蒸汽滅菌器中，在121℃下滅菌15?min。然后，把生物指示劑放在60℃培養箱中培養48?h。最后，如果安瓿的內容物呈紫紅色且澄清，則證明公司蒸汽滅菌器的滅菌過程有效，可殺滅孢子菌；如果安瓿的內容物呈橘黃色且渾濁，則證明公司蒸汽滅菌器的滅菌過程失效，不能殺滅孢子菌。滅菌過程失效會導致因檢驗物品引入微生物，造成假陽性的風險。

2實驗原理

生物指示劑與要經過高壓滅菌的待滅菌物品一起放入高壓滅菌器中［4］，在121±0.5℃（245?kPa）的壓縮蒸汽中加熱15?min后，孢子完全被殺死。高壓滅菌后，通過安瓿的培養檢查滅菌過程是否成功：嗜熱脂肪土桿菌沒有生長表明滅菌充分，反之則表明滅菌不充分。

3實驗過程

3.1 實驗材料

3.1.1 設備

本次實驗所用到的設備為YXQ-LS-100G立式壓力蒸汽滅菌器和BSP-150生化培養箱。

3.1.2 物料

本次實驗所用到的物料為生物指示劑Sterikon® plus Bioindicator。

3.2 方法與結果

3.2.1方法

3.2.1.1 流程

本次實驗的思路為通過對生物指示劑進行滅菌和培養，得到實驗結果并進行數據分析，從而得出實驗結論。

3.2.1.2 過程

步驟1：將6支生物指示劑用標簽依次標為1、2、3、4、5和6，作為實驗組；額外多準備1支生物指示劑作為對照組，一起拍照。

步驟2：將實驗組6支生物指示劑按照2支一小組，放在燒杯中。打開滅菌器，將燒杯按照上、中、下三層和待滅菌物品放在滅菌器中，拍照，關閉滅菌器。

步驟3：設置滅菌器的滅菌溫度為121℃，滅菌時間為15?min，打開滅菌器電源進行滅菌。

步驟4：待滅菌結束，將滅菌后的實驗組和對照組生物指示劑拍照。

步驟5：將滅菌后的生物指示劑及時放置在培養箱，然后調節培養溫度為60℃，并培養48?h。隨后取出培養后的生物指示劑，觀察安瓿的內容物，并與生物指示劑照片作比較。

重復步驟1至步驟5，連續驗證3次。

3.2.2合格標準

如果經滅菌和培養后，安瓿的內容物呈紫紅色且澄清，則證明公司化驗室的蒸汽滅菌器的滅菌過程有效，可殺滅孢子菌；

如果經滅菌和培養后，安瓿的內容物呈橘黃色且渾濁，則證明公司化驗室的蒸汽滅菌器的滅菌過程失效，不能殺滅孢子菌。

3.2.3結果

連續驗證3次后，實驗組安瓿的內容物都呈紫紅色且澄清。實驗結果見表1。

3.3?結論

根據表1可得知，公司化驗室的蒸汽滅菌器在121℃保持15?min滅菌的條件下，能夠殺滅孢子菌。化驗室在日常微生物檢驗過程中，用121℃條件下滅菌15?min的方式能徹底殺滅包括孢子菌在內的所有微生物，而不會因為殺菌不徹底，因微生物檢驗用物品引入微生物，造成假陽性的風險。公司化驗室的蒸汽滅菌器可滿足日常檢驗時的滅菌使用要求。

3.4?注意事項

3.4.1生物指示劑的運輸和儲藏

生物指示劑在運輸過程中，需保持其處于恒定的溫度。生物指示劑送達公司后，應立即置于冰箱冷藏柜進行冷藏；試驗室取出生物指示劑后，應盡快開始滅菌。當生物指示劑儲存于冰箱中時（恒定溫度為2～8℃），應保證其在包裝上打印的有效期之前保持穩定。室溫條件下生物指示劑的儲存周期為1～2周，儲存溫度超過30℃時會影響產品的穩定性。

3.4.2蒸汽滅菌器的確認

開展蒸汽滅菌器滅菌效果的驗證之前，應對蒸汽滅菌器實施運行確認和性能確認。運行確認是為了保證蒸汽滅菌器的運行符合設計標準；性能確認是為了保證蒸汽滅菌器在正常操作方法和工藝條件下能夠持續符合標準。

3.4.3生物指示劑的滅菌

容量不超過250?L的蒸汽滅菌器應至少使用2支安瓿進行檢查，而容量超過250?L的高壓滅菌器應至少使用6支安瓿進行檢查。（這里需要注意的是：在放入蒸汽滅菌器之前，需用力搖動每支安瓿，以分散孢子。）

為了避免意外破損造成污染，建議將安瓿放在玻璃燒杯中，并將其放在高壓滅菌器的底部或中部（通常被認為是最不利滅菌的位置）。滅菌后，取出安瓿，并在60±2℃下培養48?h。（這里需要注意的是：應避免在超過125℃的滅菌溫度下使用安瓿，以防止損壞生物指示劑。）

3.4.4生物指示劑的培養

首先需要對培養生物指示劑的培養箱實施運行確認和性能確認。運行確認是為了證明培養箱的運行符合設計標準；性能確認是為了證明培養箱在正常操作方法和工藝條件下能夠持續符合標準。將滅菌后的生物指示劑及時放置在培養箱中，然后調節培養溫度為60℃，并培養48?h。

3.4.5蒸汽滅菌器滅菌效果的驗證頻率

蒸汽滅菌器的滅菌效果驗證至少一年開展1次。

3.4.6蒸汽滅菌器滅菌驗證的文件要求

關于蒸汽滅菌器的滅菌效果驗證，首先制定驗證方案,并經審核、批準，同時驗證方案應當明確職責。其次，驗證應當按照預先確定和批準的方案實施，并記錄。驗證工作完成后,應寫出報告,并經審核、批準。驗證的結果和結論（包括評價和建議）應記錄并存檔。最后，應當根據驗證的結果確認工藝規程和操作規程。

4實驗總結

根據《藥品生產質量管理規范（2010年修訂）》、《中華人民共和國藥典（2020年版 四部）》、《YXQ-LS-100G立式壓力蒸汽滅菌器使用說明書》、《BSP-150生化培養箱（液晶顯示）使用說明書》和《Sterikon® plus Bioindicator使用說明書》制定了本次“蒸汽滅菌器滅菌效果驗證方案”，經審核、批準后按照方案進行驗證。根據驗證結果編寫了“蒸汽滅菌器滅菌效果驗證報告”，并經審核與批準。蒸汽滅菌器驗證結論為：實驗組生物指示劑經121℃滅菌15?min，60℃培養48?h后，在安瓿的內容物呈紫紅色且澄清；而對照組生物指示劑經60℃培養48?h后，在安瓿的內容物呈橘黃色且渾濁。這證明公司化驗室的蒸汽滅菌器在121℃、滅菌15?min的設置下，能夠殺滅孢子菌。化驗室在日常微生物檢驗過程中，用在121℃條件下滅菌15?min的方式，能徹底殺滅包括孢子菌在內的所有微生物，而不會因為殺菌不徹底，因微生物檢驗用物品引入微生物，造成假陽性的風險。公司化驗室的蒸汽滅菌器可滿足日常檢驗時的滅菌使用要求。                                               

【參考文獻】

［1］國家藥品監督管理局.藥品生產質量管理規范（2010年修訂），第三百一十二條和第一百三十九條.

［2］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（2020年版 四部）：204-205.

［3］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（2020年版 四部）：512-513.

［4］尚海濱.壓力蒸汽滅菌法在中藥制劑生產中的應用［J］.機電信息，2013（26）：33-38.