近年，生物類似藥研發的熱度日增，已有近200個單抗生物類似藥候選藥進入臨床研究階段，其中阿達木單抗（adamumab）是申報量最高的生物類似藥之一。截至2020年7月，我國已有2種阿達木單抗生物類似藥上市［1］，另有2個廠家產品進入申報生產階段，22個廠家產品處于臨床試驗階段。美國FDA已批準安進公司、勃林格殷格翰藥業有限公司、諾華-山德士公司、三星Bioepis／默沙東集團、輝瑞制藥有限公司和邁蘭公司／協和發酵株式會社6家公司研發的阿達木單抗生物類似藥上市，歐盟也已批準上述除輝瑞公司之外5家公司研發的阿達木單抗生物類似藥上市。

本文通過匯總與比較原研廠及國內26家阿達木單抗生物類似藥研發企業的表征分析數據，結合各國生物類似藥相關指導原則及參考文獻，對阿達木單抗生物類似藥質量相似性的技術評價要點進行初步探討。

1 阿達木單抗質量相似性評價

阿達木單抗（商品名 Humira誖）系由美國雅培公司開發，采用中國倉鼠卵巢細胞系表達制備的首個重組全人源化IgG1κ型單克隆抗體，由2條重鏈和2條輕鏈組成，共含1330個氨基酸，每條重鏈Fc部分相同糖基化位點含有典型的N-端連接糖鏈。阿達木單抗通過特異性結合可溶性腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），阻斷其與細胞表面受體 p55 和 p75 相互作用，從而有效抑制TNF-α 誘導的多種病理效應。另外，阿達木單抗還可與跨膜TNF-α 結合，通過Fcγ 受體結合的抗體依賴細胞介導的細胞毒作用（antibody-dependent cell-mediatedcytotoxicity，ADCC）和補體依賴的細胞毒作用（com-plement dependent cytotoxicity，CDC），誘導細胞凋亡等效應，清除部分致病靶細胞。

生物類似藥的研發是以原研藥的關鍵質量屬性為目標，以證實候選藥物與原研藥的質量相似性或二者結構功能差異不會引起安全性或有效性方面具有臨床意義的差異作為生物類似藥藥學開發與評價的核心［2］。在生物類似藥的開發過程中，一方面應關注原研藥上市后變更，盡可能收集較多批次的原研參照藥；一方面應關注使用統計方法的策略和相關法規隨著經驗積累進行的調整［3］。

1. 1 阿達木單抗原研產品注冊與工藝變更情況

阿達木單抗于2002年在美國注冊上市，2003年在歐盟注冊上市，現已在90多個國家和地區上市，批準用于包括類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis）、銀屑病 關節炎（psoriatic arthritis）、強直性脊柱炎（anky-losingspondylitis）、克羅恩病（Crohn disease）、斑塊銀屑病（plaque psoriasis）和潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis）、 幼年特發性關節炎（juvenile idiopathic arth-ritis）、兒童克羅恩病（Crohn disease pediatric）、特定類型葡萄膜炎（specific types of UVEITIS）、治療影像學陰性中 軸脊柱炎（nr-axSpA）等多種適應證。阿達木單抗于2010年在中國上市，先后獲批用于類風濕性關節炎、強直性脊柱炎和銀屑病3種適應證，并于2020 年獲批新增克羅恩病、幼年特發性關節炎、兒童斑塊銀屑病和葡萄膜炎 4 種適應證。

根據歐洲藥監機構公布的公眾評估報告（European Public Assessment Report，EPAR）信息，阿達木單抗自2002年上市后至少經過28次不同風險等級的工藝變更，包括8次低風險變更，17次中度風險變更和3次重大風險變更［4］。從阿達木單抗原研公司在我國藥品再注冊和補充申請等受理情況分析，中國已上市的阿達木單抗在原液生產場地、生產工藝、包材、包裝規格、制劑處方等方面的確存在多次工藝變更。上述工藝變更可能導致阿達木單抗的質量在其產品生命周期內發生“漂移”。

1. 2 生物類似藥質量相似性評價的一般考慮

物制品具有分子量大、結構復雜、生物活性對其結構完整性依賴性強、變異體多、生產工藝復雜等特點［5］，因此，隨著國內外生物類似藥研發和評價的不斷深入，生物類似藥相似性評價標準的推出尤為重要。我國于2015年發布了《生物類似藥研發與評價技術指導原則（試行）》，明確了相似性評價的基本原則，包括比對原則、逐步遞進原則、一致性原則和相似性評價原則［6］。

通過借鑒國際相關法規政策和近年的審評經驗積累，國家藥品監督管理局藥品審評中心于2020年8月發布了《生物類似藥相似性評價和適應證外推技術指導原則（征求意見稿）》，提出相似性是指生物類似藥與參照藥之間高度相似，在純度、安全性及有效性不存在有臨床意義的差別。進一步明確了應基于對參照藥質量屬性的認知程度及其與臨床風險獲益的相關性，對質量屬性進行高、中、低風險的分級。高、中風險質量屬性可采用驗收標準范圍方法進行定量評估；低風險和無法采用定量方法評價的質量屬性可采用頭對頭定性比對或圖譜比對的方法進行評估。用于定量評估的質量范圍通常定義為μR - XσR ／ μR + XσR，其中μR為檢測樣本的平均值，σR為標準偏差，系數X的設定需根據質量屬性的風險等級和方法的變異性等進行科學論證，針對高風險質量屬性應合理收緊系數。根據質量屬性權重和相似性評價目標，也可采用其他統計方法進行數據分析，如等效性檢驗。鼓勵采用先進的、靈敏度高的技術和方法對候選藥和參照藥開展全面質量比對研究。對候選藥與參照藥存在的與臨床風險獲益相關性認知尚不充分的差異，應設計針對性的比對試驗研究，以證實質量差異的不確定性對藥物安全性、有效性和免疫原性等方面的影響。必要時，還需要提供額外的非臨床和／或臨床證據，科學地論證質量差異是否具有臨床意義［7］。

1. 3 關鍵質量屬性的識別

阿達木單抗屬于典型的IgG1型單克隆抗體，糖基化修飾復雜，具有多種質量屬性，根據對其生物學活性、藥代動力學（pharmacokinetic，PK）、安全性和免疫原性的潛在影響及對應的臨床用藥風險獲益程度，確定阿達木單抗的關鍵質量屬性并對質量屬性進行風險等級排序，見表1［8］。

1. 4 關鍵質量屬性相似性評價

匯總26家國內阿達木單抗生物類似藥廠家（共109批，其中37批重復）、原研藥廠家（30批）、中國食品藥品檢定研究院（簡稱中檢院）質量復核（9批）的質量研究數據，并結合文獻［2，9-10］對阿達木單抗原研藥的關鍵質量屬性檢測數據，統計后確認初步質量相似性評價標準（Mean±3 SD），再評估各家候選藥的各質量屬性檢測結果是否符合該相似性評價標準范圍。

1. 4. 1 結構確證

1. 4. 1. 1 氨基酸序列

生物類似藥研發的前提是氨基酸序列的一致性，通常多種酶切后采用液相色譜- 質譜聯用（簡稱液質聯用）的方法進行肽圖檢測，大部分阿達木單抗生物類似藥候選藥的二級質譜覆蓋率可達100%，同時應證明氨基酸序列與參照藥一致。

1. 4. 1. 2 分子量

單抗分子量包括完整分子量、還原和去糖后重鏈及輕鏈分子量。完整分子量通常采用點噴射離子化飛行時間質譜進行檢測；還原態的去糖基化重鏈和輕鏈的質量分析則多采用多肽-N-糖苷酶（PNGase F）去除N連接的糖鏈后變性還原，再 進行液質聯用分析。各廠家的阿達木生物類似藥候選藥切糖分子量與參照藥一致性良好，通常切糖后重鏈和輕鏈分子量分別為49200 和23412，與理論值一致。完整蛋白水平的分析難以提供糖基化修飾的精細信息，在質譜法測定中易受蛋白同位素峰的影響，僅可提供抗體的平均分子量信息。鑒于目前收集到的各家完整蛋白分子量批次有限，暫未納入統計。但候選藥廠家應盡可能采用高分辨率質譜與參照藥開展頭對頭的檢測，并分析各分子量與參照藥的異同。

1. 4. 1. 3 二硫鍵及自由巰基

通過比較還原條件和非還原條件下的肽圖，可鑒別出含有二硫鍵的多肽，進一步確認二硫鍵的結構。阿達木單抗共有16對二硫鍵，包含12對鏈內二硫鍵及4對鏈間二硫鍵，理論上不應存在游離巰基。對各廠家二硫鍵鑒定結果均與理論一致，自由巰基含量一致性良好，均保持在極低水平。

1. 4. 1. 4 糖基化修飾

通常采用PNGaseF酶切糖鏈，經糖鏈熒光標記后通過液質聯用進行糖型分析。阿達木單抗的糖基化位點位于重鏈第301位天冬酰胺（Asn）上，主要糖型為巖藻糖基化二天線寡糖（如G0F、G1F、G2F等），占糖型總量的82.3%~95. 1%，其中G0F占74.3%~76.5%，G1F+G2F占13.3%~24.9%［9］，其他糖型還有G0、高甘露寡糖（如 Man5、Man6 等）、半乳糖基化、唾液酸化等。其中，半乳糖基化基團包括全部復合物及至少含 1 個末端半乳糖的雜合聚糖結構，半乳糖基化對補體C1q 與IgG1 的結合較重要，是通過CDC 激活 IgG1 介導細胞裂解的關鍵步驟；高甘露糖聚糖類型是人血清 IgGs 中天然存在的，可通過結合至甘露糖結合受體引起清除 率變化而影響PK，并通過結合 FcγRⅢa 影響 ADCC活性，如 Fc 端 N-連接聚糖缺少核心巖藻糖可顯著提高 IgG1 結合至 FcγRⅢa 的親和力，從而提高ADCC活性；唾液酸含量會影響 PK 和有效性［11］，但阿達 木單抗的唾液酸含量較低，對產品功能相似性影響較 小。另外，阿達木單抗具有一定的ADCC 和 CDC 效 應，與跨膜 TNF-α 作用機制相關的克羅恩病和葡萄膜炎可能與此有關，在適應證外推中應考慮影響ADCC和CDC效應的糖基化水平。鑒于糖基化與阿達木單抗的生物活性、有效性、安全性及 PK 等密切相關，不同生物類似藥應與原研藥具有相似的糖型分布。

各生物類似藥廠家獲得的阿達木單抗主要糖型的分布較為相似，但由于各家對糖型的分類、采用的檢測方法及積分計算方法不同，原研廠家自測和生物類似藥廠家測定的參照藥糖型含量區間范圍存在一定差異，個別候選藥的部分糖型含量超出了初步擬定的相似性標準范圍。部分候選藥主要糖型含量見圖1。

1. 4. 1. 5 高級結構

一般采用圓二色譜法、熒光光譜法及差示掃描量熱法等進行單克隆抗體高級結構的檢測，候選藥應與參照藥進行頭對頭分析比較，檢測圖譜、吸收峰和Tm值應與參照藥一致。

1. 4. 1. 6 等電點

等電點受蛋白質氨基酸序列和高級結構的影響，一般采用毛細管等電聚焦（capillary isoelectric focusing，cIEF）法檢測等電點。阿達木單抗為糖基化蛋白，等電點的圖譜為一組峰，各峰的出峰時間與峰高應與原研藥一致。各生物類似藥廠家的主峰出峰時間與參照藥基本一致，但酸性峰和堿性峰分布存在一定差異。

1. 4. 2 生物活性

阿達木單抗功能相似性評價包括與可溶性TNF-α 的結合動力學及與跨膜 TNF-α 相對結合力的檢測，同時還應檢測 TNF-α 細胞毒中和作用及與Fcγ 受體（FcRⅠa、FcRⅡa、FcRⅢa）和新生兒受體（FcRn）的結合能力，并分析其 ADCC 及 CDC 活性。通常采用 ELISA 法測定與可溶性 TNF-α 的相對結 合力，細胞凋亡抑制法檢測細胞活性，表面等離子體 共振法（surface plasmon resonance，SPR）測定樣品和TNF-α 和 Fc 受體的親和力。

1. 4. 2. 1 結合活性

采用ELISA法檢測樣品與可溶性TNF-α的結合能力，一般擬定質量標準為對照品的75%~ 125%。

1. 4. 2. 2 細胞活性

TNF-α 可誘導 L-929 小鼠成纖維細胞凋亡，TNF-α 與阿達木單抗特異性結合后，阻斷了其對靶細胞的凋亡作用，中和了其對 L-929 細胞毒性。采用TNF-α 細胞毒中和法，通過比較參比品和供試品的 EC50 值，計算供試品的凋亡抑制生物活性。一般擬定質量標準范圍為對照品的 80% ~ 125%，由于方法的變異性較大，部分生物類似藥企業擬定質量標準為 70% ~ 150%。鑒于候選藥質量標準應不低于參照藥，建議通過方法優 化提高方法的精密度，盡量收緊至原研藥的質量標 準范圍。

1. 4. 2. 3 Fc 受體及 C1q 親和力

抗體Fc端與免疫細胞表達的 Fc 受體（FcRⅠa、FcRⅡa、FcRⅢa）、新生兒受體（FcRn）及血液中的補體（C1q）的結 合對抗體的 PK 有一定影響，因此需要關注候選藥與參照藥在樣品Fc端多種受體親和力方面的 相似性。Fc受體及 C1q 親和力通常采用SPR法檢測 ，方法的變異性使各家檢測結果差異較大，因此在相同檢測條件下的頭對頭研究十分 必要。

1. 4. 2. 4 ADCC 和 CDC 活性

通常阿達木單抗與可溶性 TNF-a 結合不具有ADCC和CDC活性，但與跨膜TNF-α結合后可發揮ADCC和CDC活性。ADCC檢測一般采用報告基因檢測系統，靶細胞為細胞表面表達 TNF-α 的 CHO-K1 ／ hmTNF-α 細胞， 阿達木單抗可與細胞膜表面 TNF-α 結合，啟動效應細胞報告基因表達，促進發光底物發光，發光程度與 抗體濃度呈正相關。CDC通過阿達木單抗與CHOK1 ／ hmTNF-α 細胞表面表達的 TNF-α 結合，形成復合物激活補體經典途徑，所產生的攻膜復合物對靶細 胞發揮裂解作用，通過乳酸脫氫酶（lactatedehy-drogenase，LDH）及鈣黃綠素（calcein AM）的釋放來檢測CDC作用，其顯色程度與抗體濃度呈正相關。由于各廠家檢測生物活性時均采用自制對照品作為標 準品，橫向比較和統計各廠家生物活性檢測結果意義較小。統一國家標準品的建立將有助于同類產品生物活性等質量的平行對比。

1. 4. 3 純度

1. 4. 3. 1 SEC-HPLC 純度通常采用SEC-HPLC法檢測分子大小異構體，主峰前后分別是聚體和降 解片段。聚體的存在會帶來免疫原性風險，并影響PK；降解片段可能會造成結合活性下降，對有效性產生影響。各生物類似藥廠家測得的阿達木單抗單體純度范圍為 98. 5% ~ 100. 6%，個別候選藥廠家的檢測結果超出相似性驗收范圍，低于該項質量標準，部分結果見圖2，作為較嚴重的缺陷項可判斷為該項不符合相似性判斷標準。

1. 4. 3. 2 CE-SDS 純度

在還原條件及非還原條件下，根據分子量大小的不同采用CE-SDS法進行純度檢測，能檢測到降解片段和非糖基化重鏈，檢測結果可反映抗體結構的完整性。各廠家測得阿達木單抗的還原CE-SDS的重鏈 + 輕鏈純度范圍為 96. 6% ~99. 3%，非還原CE-SDS 的重鏈 + 輕鏈純度范圍為94. 1% ~ 100. 2%，部分結果見圖 3。

1. 4. 3. 3 SDS-PAGE 純度

SDS-PAGE可將蛋白質按分子大小分離，包括還原SDS-PAGE和非還原SDSPAGE。各廠家測得阿達木單抗的輕鏈和重鏈條帶總含量范圍為96. 6% ~ 99. 3%。

1. 4. 3. 4 CEX-HPLC 純度

目前最常采用CEXHPLC檢測單抗的電荷異構體，除主峰外的酸性峰和堿性峰對生物活性均有影響。各廠家測得阿達木單抗CEX-HPLC純度的可見主峰與堿性峰之和均在一定的質量范圍內，與文獻報道 85. 62% ~ 87. 59%的結果相近［11］。個別候選藥的主峰和堿性峰含量超出了初步擬定的相似性標準范圍，部分結果見圖4，可能與樣品前處理有關，建議在頭對頭對比的基礎上盡可能保證電荷異構體與原研藥的相似性。對堿性峰含量產生影響的原因之一是C-末端賴氨酸含量，但通常認為由C-末端賴氨酸產生的堿性峰含量的差異不會影響PK 及有效性和安全性。

中檢院及生物類似藥廠家檢測參照藥的純度結果與原研自測結果存在一定差異，提示檢測方法對結果可能有較大影響，如色譜柱、洗脫條件、樣品前處理等，因此生物類似藥廠家進行參照藥與候選藥頭對頭研究的結果更具有參考意義。

1. 4. 4 工藝相關雜質

主要包括工藝過程中可能引入的雜質，通常有宿主細胞蛋白質殘留量、外源性DNA殘留量、蛋白質A殘留量及生產過程中其他的添加物（如消泡劑、胰島素等）。工藝相關雜質并非相

似性評價關鍵項目，主要影響產品的安全性，通常不要求進行頭對頭對比研究，但應進行工藝相關雜質的去除研究，并對殘留量進行安全性風險分析，應不低于已上市同類產品的要求。

2 參照藥及候選藥的選擇標準

2. 1 參照藥及候選藥的選擇

藥學的質量相似性研究是候選藥作為生物類似藥開發的前提。應在對參照藥的關鍵質量屬性有充分的認識和理解的基礎上，采用多種先進、靈敏的技術手段對足夠批次的參照藥進行全面分析，合理設定質量相似性的驗收標準。由于單克隆抗體存在多種翻譯后修飾、結構復雜，具有電荷異質性和分子量大小的異質性及批間的不均一性，因此在參照藥的選擇上，應盡可能收集跨越較長時間范圍的多批次來源中國市場的原研藥進行表征分析，其他國家來源原研藥的質量屬性可作為參考，但不作為主要評價依據。候選藥應基于質量源于設計的理念，充分考慮生產中使用的原材料、生產工藝、規模、場地、制劑處方、包材等，將具有代表性的批次用于相似性評價的質量研究中［12］。

生物類似藥研發中，應納入盡可能多批次的參照藥與候選藥，以便相似性分析結果具有統計學意義。申報臨床試驗階段，通常應采用至少3批候選藥與至少3批參照藥進行頭對頭對比研究；申報上市階段，應積累10批以上的原研藥和候選藥的質量研究數據，其中候選藥批次中應納入臨床試驗批樣 品、擬上市商業化生產規模批次的代表性樣品［13-14］。為確保研發各階段良好的銜接，關鍵臨床試驗前應確定生產工藝、生產規模及生產場地等。

2. 2 相似性評價

由于原研藥生產工藝信息獲取的有限性及生物制品生產工藝的復雜性，難以驗證兩種來源的生物制品在結構和組成方面的完全一致性，候選藥和原研藥通常在分子量大小異質性、電荷異質性、糖基化程度方面存在差異。對于質量相似性評價中觀察到的差異，應提供更多的支持性資料（包括對安全性、有效性、免疫原性和PK／PD的影響及進一步的研究數據等），來說明存在的差異是否影響候選藥與參照藥相似性的判斷。在某些情況下，可通過部分調整生產工藝來減小或消除觀察到的差異，并確保其他的質量屬性不會因此受到顯著影響［15］。

3 小結

本文基于審評實踐所積累的數據，采集了不同生物類藥廠家、原研廠家及中檢院對阿達木單抗的檢測結果。上述數據來源于不同實驗室，分析方法、樣品來源、樣品出廠后放置時間、參照藥自身的工藝變更和場地變更等可能存在差異，因此，根據上述數據設定的質量相似性標準范圍較為寬泛，雖然 對生物類似藥廠家的藥學研發具有一定參考價值，但建議僅將此標準作為基本參考。對于質量相似性評價，更有意義的是采用靈敏的分析方法對候選藥和參照藥進行頭對頭的比較分析。另外，原研藥與候選藥頭對頭的圖譜比對分析、穩定性變化趨勢、降解途徑和降解速率的對比也非常重要，但目前采集的數據中，圖譜比對和穩定性趨勢對比分析的數據有限，本文僅對可用于統計分析的數據進行了梳理，因此得到的質量相似性評價標準具有一定的局限性。生物類似藥研發持續深入推進，隨著原研藥質量研究數據的不斷積累及分析技術的進步和統計經驗的豐富，生物類似藥質量相似性評價標準也會日趨完善。

作者：程速遠，趙靖，胡瑩瑩，白玉（CDE）

來源：中國生物制品學雜志 2021.05