紫外-可見(UV-Vis)光譜是一種廣泛應用于許多科學領域的技術，從細菌培養、藥物鑒定和核酸純度檢查和定量，到飲料行業的質量控制和化學研究。本文將介紹UV-Vis光譜的工作原理、如何分析輸出數據、該技術的優勢和局限性以及它的一些應用。

 

什么是紫外可見分光光度計？

 

UV-Vis光譜是一種分析技術，它測量與參考或空白樣品相比樣品吸收或透射過的UV或可見光的離散波長的數量。此屬性受樣品成分的影響，分析結果可能會提供有關樣品中成分和濃度的信息。由于這種光譜技術依賴于光的使用，所以讓我們首先談一談光的特性。

 

光具有與其波長成反比的一定量的能量。因此，較短波長的光攜帶更多的能量，而較長波長的光攜帶較少的能量。需要特定量的能量來將物質中的電子提升到更高的能量狀態，我們可以將其檢測為吸收。物質中不同鍵合環境中的電子需要不同的特定能量來將電子提升到更高的能量狀態。這就是為什么在不同物質中對不同波長會發生光吸收的原因。人類能夠看到一系列可見光，從大約380nm（我們看到的紫色）到780nm（我們看到的紅色）。紫外光的波長比可見光短，約為100nm。因此，光可以通過其波長來描述，這在UV-Vis光譜中可用于通過定位與最大吸光度相對應的特定波長來分析或識別不同的物質（參見下文中UV-Vis光譜的應用部分）。

 

紫外可見分光光度計如何工作？

 

雖然UV-Vis分光光度計有許多類型，但為了更好地了解UV-Vis分光光度計的工作原理，我們主要考慮分光光度計的主要組件，如下圖1所示。

 

 

圖1：紫外可見分光光度計主要組件的示意圖。

 

1、光源

 

作為一種基于光的技術，一個能夠在很寬的波長范圍內發射光的穩定光源是必不可少的。單個氙氣燈通常用作紫外線和可見光范圍的高強度光源。然而，與鎢燈和鹵素燈相比，氙氣燈的成本更高且穩定性較差。

 

對于使用兩個燈的儀器，鎢燈或鹵素燈通常用于可見光，而氘燈是紫外光的常見光源。由于需要兩種不同的光源來掃描紫外和可見波長，因此在測量過程中必須切換儀器中的光源。在實踐中，這種切換通常發生在300和350nm之間的掃描范圍，其中來自兩個光源的光發射相似，并且可以更平滑地進行轉換。

 

2、波長選擇

 

在下一步中，必須從光源發出的寬波長中選擇適合用于檢測的樣品類型和分析物的特定波長的光進行樣品檢查。常用的方法包括：

 

單色器

 

單色器將光分成窄的波長帶。它通常基于可以旋轉的衍射光柵來選擇入射角和反射角，從而選擇所需的光波長。衍射光柵的凹槽頻率通常以每毫米的凹槽數來衡量。更高的凹槽頻率提供更好的光學分辨率，但可用波長范圍更窄。較低的凹槽頻率提供較大的可用波長范圍，但光學分辨率較差。每毫米300到2000個凹槽可用于紫外可見光譜目的，但通常每毫米至少有1200個凹槽。光譜測量的質量對衍射光柵和光學裝置中的物理缺陷很敏感。因此，刻劃衍射光柵往往比閃耀全息衍射光柵具有更多的缺陷。閃耀全息衍射光柵往往能提供明顯更好的測量質量。

 

吸收濾光片

 

吸收濾光片通常由有色玻璃或塑料制成，旨在吸收特定波長的光。

 

干涉濾光片

 

也稱為二向色濾光片，這些常用的濾光片由多層介電材料制成，其中在薄層材料之間發生干涉。這些濾光片可用于通過相消干涉消除不需要的波長，從而充當波長選擇器。

 

截止濾光片

 

截止濾光片允許低于（短波）或高于（長波）特定波長的光通過。這些通常使用干涉濾波器來實現。

 

帶通濾波器

 

帶通濾波器允許一系列波長通過，這可以通過將短波和長波濾波器組合在一起來實現。

 

由于其多功能性，單色儀最常用于該過程。然而，濾光片通常與單色器一起使用，以縮小選擇的光波長以進行更精確的測量并提高信噪比。

 

3、樣品分析

 

無論在分光光度計中使用哪種波長選擇器，光都會穿過樣品。對于所有分析，測量參考樣品（通常稱為“空白樣品”）（例如裝有用于制備樣品的類似溶劑的比色皿）是必不可少的。如果使用含有樣品的緩沖溶液進行測量，則使用不含目標物質的緩沖溶液作為參考。檢查細菌培養物時，將使用無菌培養基作為參考。參考樣品信號隨后由儀器自動使用，以幫助獲得分析物的真實吸光度值。

 

了解UV-Vis光譜實驗中使用的材料和條件非常重要。例如，大多數塑料比色皿不適用于紫外線吸收研究，因為塑料通常會吸收紫外線。玻璃可以充當過濾器，通常會吸收大部分UVC(100-280nm)和UVB(280-315nm)但允許一些UVA(315-400nm)通過。因此，紫外檢測需要石英樣品架，因為石英對大部分紫外光是透明的?？諝庖部梢员徽J為是一種過濾器，因為波長短于約200nm的光被空氣中的分子氧吸收。波長小于200nm的測量需要特殊且更昂貴的設置，通常涉及充滿純氬氣的光學系統。無比色皿系統也可用于分析非常小的樣品體積，例如在DNA或RNA分析中。

 

4、檢測

 

光線穿過樣品后，檢測器用于將光線轉換為可讀的電子信號。通常，探測器基于光電涂層或半導體。

 

光電涂層在暴露于光噴出帶負電荷的電子。當電子被射出時，會產生與光強成正比的電流。光電倍增管(PMT)是紫外-可見光譜中較常用的檢測器之一。參考下圖2，PMT基于光電效應，在曝光時首先發射電子，隨后發射的電子依次倍增以產生更大的電流。PMT檢測器對于檢測非常低的光強度特別有用。

 

當半導體暴露在光下時，可以通過與光強成正比的電流。更具體地說，光電二極管和電荷耦合器件(CCD)是兩種最常見的基于半導體技術的檢測器。

 

使用任何探測器產生電流后，信號就會被識別并輸出到計算機或屏幕上。如上圖2和下圖3顯示了紫外-可見分光光度計布置的一些簡化示意圖。

 

 

圖2：基于比色皿的紫外-可見光譜系統示意圖。

 

 

圖3：無比色皿UV-Vis光譜系統示意圖。

 

紫外-可見光譜分析、吸收光譜和吸光度單位

 

UV-Vis光譜信息可以表示為吸光度、光密度或透射率與波長的函數關系圖。但是，該信息通常以y軸（縱軸）上的吸光度和x軸（橫軸）上的波長的圖形形式呈現。該圖通常稱為吸收光譜，如下圖4所示。

 

 

圖4：從紫外-可見分光光度計獲取的吸收光譜圖。檢查的樣品是溶解在中性pH磷酸鹽緩沖液中的血紅蛋白。

 

根據本文前一節中介紹的紫外-可見分光光度計儀，可以合理地預期光強度與樣品吸收的光量定量相關。

 

吸光度（A）等于涉及的光的強度通過樣品之前的對數值（Io）通過的光的強度通過樣品（I）。I除以Io的分數也稱為透射率(T)，它表示通過樣品的光量。然而，當摩爾吸光率(ε)和路徑長度(L)已知時，比爾-朗伯定律（Beer-Lambert）通常用于在測量吸光度(A)后獲得樣品的濃度(c)。通常，ε以L﹒mol-1cm-1為單位表示，L以cm為單位，c以mol/L為單位表示。因此，A沒有單位。

 

有時AU用于表示任意單位或吸光度單位，但一般建議不要這樣表示。

 

如果使用一組測量的包含相同物質的標準溶液存在線性關系，Beer-Lambert定律對于獲得物質的濃度特別有用。公式1顯示了吸光度、比爾-朗伯定律、儀器中測量的光強度和透射率之間的數學關系。

 

 

公式1：此方程顯示了吸光度A、比爾-朗伯定律、儀器中測量的光強度和透射率之間的關系。

 

光密度(OD)有時會錯誤地與吸光度互換使用。OD和吸光度都測量光學組件中光強度損失的量，但OD考慮了光散射的損失，而吸光度則沒有。如果測量中存在非常少的光散射，則可以使用吸光度直接近似估計OD，并且可以使用Beer-Lambert定律。

 

在測量過程中了解實驗條件很重要。用于1cm路徑長度的比色皿是標準的并且是最常見的。有時，可用于檢查的樣本非常少，因此需要小至1毫米的較短路徑長度。如果需要定量，吸光度值應保持在1以下，并且保持在儀器的動態范圍內。這是因為吸光度為1意味著樣品吸收了90%的入射光，或者等效地表述為10%的入射光透過樣品。由于到達檢測器的光很少，一些紫外-可見分光光度計不夠靈敏，無法可靠地量化少量光。解決這個問題的兩個簡單可能的解決方案是稀釋樣品或減少路徑長度。

 

如上所述，使用“空白”參考溶液記錄基線光譜是必不可少的。如果儀器在各方面都絕對完美，那么基線對每個檢測波長的吸光度都為零。然而，在實際情況下，基線光譜通常會有一些非常小的正負吸光度值。為實現最佳實踐，軟件通常會自動從每個光波長的樣品吸光度值中減去這些小的吸光度值，以獲得真實的吸光度值。

 

根據分析的目的，可能需要構建校準曲線。建立校準曲線需要一些數據分析和額外的工作，但根據吸光度測量值準確確定樣品中特定物質的濃度非常有用。然而，在許多情況下不需要校準曲線，包括用于細菌培養的OD測量、在特定波長處獲取吸光度比以評估核酸純度或識別某些藥物。

 

在紫外可見分光光度計中，選擇對應于目標物質最大吸光度的波長進行分析。這種選擇確保了最大的靈敏度，因為對于特定的分析物濃度可以獲得最大的響應。下圖5提供了Food Green 3（一種染料）的UV-Vis吸收光譜示例和使用標準溶液的相應校準曲線。請注意，Food Green 3染料中存在兩個最大吸收峰，一個較小的最大吸收峰位于435nm，在619nm處有一個更強烈的最大吸收峰。為了在計算未知濃度的Food Green 3時獲得最大靈敏度，使用619nm處的最大吸光度峰進行分析。通過稀釋溶液，進行吸光度測量，然后將它們繪制在吸光度與濃度的關系圖上，以建立濃度和吸光度之間的數值關系，從而制備了一系列已知濃度的標準溶液。使用最小二乘線性回歸方程創建校準曲線。數據點越接近直線，擬合越好。直線方程中的y截距設置為零以表示當不存在染料時沒有吸光度。下圖5中所示的方程用于根據測得的吸光度（變量y）計算未知樣品中Food Green 3（變量x）的濃度。

 

 

圖5：左圖顯示了從樣品中的Food Green 3的UV-Vis光譜。右圖顯示的校準曲線，使用最小二乘線性回歸方程從Food Green 3的標準稀釋溶液中得出的。

 

對于數據分析，吸光度與濃度的關系圖可以表明系統在構建校準曲線時的靈敏度。當使用線性最小二乘回歸方程時，最佳擬合線的斜率表示靈敏度。如果斜率更陡，則靈敏度更高。靈敏度是區分樣品濃度微小差異的能力。根據 Beer-Lambert 定律，靈敏度可以部分地由摩爾吸收率ε 表示。事先了解ε值（如果有）有助于確定所需樣品的濃度，尤其是在樣品有限或昂貴的情況下。

 

為了可靠性和最佳實踐，應重復紫外-可見光譜實驗和讀數。在重復檢查樣品時，通常至少進行3次重復試驗是常見的，但在某些工作領域需要進行更多次重復試驗。計算出的數量，例如未知樣品的濃度，通常報告還應該帶有標準偏差的平均值?？芍噩F的結果對于確保精確、高質量的測量至關重要。標準偏差、相對標準偏差或變異系數有助于確定系統和測量的精確度，較低的偏差或變化表明較高的精度和可靠性水平。

 

紫外可見分光光度計的優勢和局限性

 

沒有一種技術是完美的，紫外-可見光譜也不例外。但是，該技術確實具有以下的一些主要優勢，使其應用廣泛。

 

該技術是非破壞性的，允許重復使用樣品或進行進一步處理或分析；

 

可以快速進行測量，從而可以輕松集成到實驗方案中；

 

儀器易于使用，使用前幾乎不需要培訓；

 

數據分析通常需要少許的處理，這同樣意味著需要很少的用戶培訓；

 

該儀器的購置和操作成本通常較低，因此可供許多實驗室使用。

 

雖然這種技術的優勢看起來非常明顯，但也存在一定的弱點：

 

雜散光

 

在實際儀器中，波長選擇器并不完美，來自寬波長范圍的少量光仍可能從光源傳輸，這可能會導致嚴重的測量錯誤。雜散光也可能來自環境或儀器中安裝松散的隔間。

 

光散射

 

光散射通常是由液體樣品中的懸浮固體引起的，這可能會導致嚴重的測量誤差。比色皿或樣品中存在的氣泡會散射光，導致無法重現的結果。

 

來自多個吸收物種的干擾

 

例如，樣品可以具有多種類型的綠色葉綠素。在同一樣品中一起檢查時，不同的葉綠素將具有重疊的光譜。為了進行適當的定量分析，應將每種化學物質從樣品中分離出來并單獨檢查。

 

組件的偏差

 

任何儀器組件未對準定位，尤其是固定樣品的比色皿，都可能產生不可重復和不準確的結果。因此，重要的是儀器中的每個組件都以相同的方向對齊，并在每次測量時放置在相同的位置。因此，一般建議進行一些基本的操作培訓，以避免誤差。

 

紫外可見分光光度計的應用 

 

UV-Vis已發現其適用于許多用途和情況，包括但不限于：

 

1、DNA和RNA分析

 

快速驗證RNA和DNA的純度和濃度是一種特別廣泛的應用。下表1中給出了分析中使用的波長及其指示的摘要。在制備DNA或RNA樣品時，例如用于測序等下游應用時，通常重要的是要驗證其中一個樣品沒有被其他，或從分離過程中攜帶的蛋白質或化學物質。

 

260nm/280nm吸光度(260/280)比值可用于揭示核酸樣品中可能存在的污染，如下表2所示。純DNA的260/280比值通常為1.8，而純RNA的比值通常為2.0 .純DNA的260/280比值低于RNA，因為在RNA中被尿嘧啶取代的胸腺嘧啶的260/280比值低于尿嘧啶。由于280nm處的吸光度較高，被蛋白質污染的樣品會降低260/280比值。

 

用于吸光度分析的波長（nm）	這個波長的紫外吸光度表明存在什么物質？	是什么導致此波長的紫外線吸收？
230	蛋白質	蛋白質形狀
260	DNA和RNA	腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶
280	蛋白質	主要是色氨酸和酪氨酸

 

表1：確定260/280和260/230吸光度比值時有用的UV吸光度匯總。

 

吸光度比	典型值
260/280	純DNA的典型吸光度比為1.8 純RNA典型的吸光度比為2.0
260/230	吸光度比不同；2.15至2.50典型值用于RNA和DNA

表2：DNA和RNA分析的預期紫外線吸光度比值總結。

 

260nm/230nm吸光度(260/230)比率也可用于檢查DNA和RNA樣品的純度，并可揭示蛋白質或化學污染。蛋白質可以吸收230nm的光，從而降低260/230比率并指示DNA和RNA樣品中的蛋白質污染。硫氰酸胍和異硫氰酸胍是純化核酸中常用的兩種化合物，在230nm處有強烈吸收，這也會降低260/230的吸光度比值。

 

2、藥物分析

 

UV-Vis光譜最常見的用途之一是在制藥行業。使用數學導數處理UV-Vis光譜允許解析原始光譜中的重疊吸收峰以識別單個藥物化合物。例如，苯佐卡因（一種局部麻醉劑）和金霉素（一種抗生素）可以通過將第一個數學導數應用于吸光度光譜，同時在商業獸用粉末制劑中進行鑒定。通過為每種化合物構建校準函數，可以在微克/毫升的濃度范圍內同時定量這兩種物質。

 

3、細菌培養

 

紫外可見分光光度計常用于細菌培養。OD測量通常使用600nm的波長快速進行，以估計細胞濃度并跟蹤生長。600nm是常用和優選的，因為它們在其中生長的細菌培養基的光學特性以及避免在需要繼續實驗的情況下損壞細胞。

 

4、飲料分析

 

識別飲料中的特定化合物是紫外可見光譜的另一個常見應用?？Х纫蚝勘仨氃谝欢ǖ姆上拗苾?，紫外線可以促進量化。某些類別的有色物質，例如在藍莓、覆盆子、黑莓和櫻桃中發現的花青素，可以通過匹配它們在葡萄酒中的已知峰值吸收波長來輕松識別，以便使用紫外可見吸收進行質量控制。

 

5、其他應用

 

這種技術也可用于許多其他行業。例如，測量顏色指數可用于監控變壓器油，作為確保電力安全輸送的預防措施。測量血紅蛋白的吸光度以確定血紅蛋白濃度可用于癌癥研究。在廢水處理中，UV-Vis光譜可用于動力學和監測研究，通過比較一段時間內的光譜，確保某些染料或染料副產品已被正確去除。

 

UV-Vis光譜在一些更專業的研究中也非常有用。在對應于吸收峰的波長的跟蹤變化是在檢查特定結構蛋白改變有用和在確定電池組合物。峰值吸收波長的偏移也可用于更現代的應用，例如非常小的納米粒子的表征。這種技術的應用多種多樣，而且似乎無窮無盡。

 

圖片參考：

 

1.Harris DC. Quantitative Chemical Analysis. 7th ed, 3rd printing.W. H. Freeman; 2007.

2.Diffey BL.Sources and measurement of ultraviolet radiation. Methods. 2002;28(1):4-13.doi:10.1016/S1046-2023(02)00204-9

3.Namioka T.Diffraction Gratings. In: Vacuum Ultraviolet Spectroscopy. Vol 1. ExperimentalMethods in Physical Sciences. Elsevier; 2000:347-377. doi:10.1016/B978-012617560-8/50018-9

4.MortimerAbramowitz and Michael W. Davidson. Photomultiplier Tubes. MolecularExpressions. Accessed April 25, 2021. https://micro.magnet.fsu.edu/primer/digitalimaging/concepts/photomultipliers.html

5.Picollo M,Aceto M, Vitorino T. UV-Vis spectroscopy. Phys Sci Rev. 2019;4(4). doi:10.1515/psr-2018-0008

6.What is aPhotodiode? Working, Characteristics, Applications. Published online October30, 2018. Accessed April 29, 2021. https://www.electronicshub.org/photodiode-working-characteristics-applications/

7.Amelio G.Charge-Coupled Devices. Scientific American. 1974;230(2):22-31. http://www.jstor.org/stable/24950003

8.Hackteria. DIYNanoDrop. Accessed June 15, 2021. https://hackteria.org/wiki/File:NanoDropConceptSpectrometer2.png

9.Sharpe MR.Stray light in UV-VIS spectrophotometers. Anal Chem. 1984;56(2):339A-356A. doi:10.1021/ac00266a003

10.Liu P-F,Avramova LV, Park C. Revisiting absorbance at 230nm as a protein unfoldingprobe. Anal Biochem. 2009;389(2):165-170. doi:10.1016/j.ab.2009.03.028

11.Kalb V.,Bernlohr R. A New Spectrophotometric Assay for Protein in Cell Extracts. AnalBiochem. 1977;82:362-371. doi:10.1016/0003-2697(77)90173-7

12.Bosch Ojeda C,Sanchez Rojas F. Recent applications in derivative ultraviolet/visibleabsorption spectrophotometry: 2009–2011. Microchem J. 2013;106:1-16. doi:10.1016/j.microc.2012.05.012

13.Domingo C,Saurina J. An overview of the analytical characterization of nanostructureddrug delivery systems: Towards green and sustainable pharmaceuticals: A review.Anal Chim Acta. 2012;744:8-22. doi:10.1016/j.aca.2012.07.010

14.Gaikwad J,Sharma S, Hatware KV. Review on Characteristics and Analytical Methods ofTazarotene: An Update. Crit Rev Anal Chem. 2020;50(1):90-96. doi:10.1080/10408347.2019.1586519

15.Gendrin C,Roggo Y, Collet C. Pharmaceutical applications of vibrational chemical imagingand chemometrics: A review. J Pharm Biomed Anal. 2008;48(3):533-553. doi:10.1016/j.jpba.2008.08.014

16.Lourenço ND,Lopes JA, Almeida CF, Sarraguça MC, Pinheiro HM. Bioreactor monitoring withspectroscopy and chemometrics: a review. Anal Bioanal Chem.2012;404(4):1211-1237. doi:10.1007/s00216-012-6073-9

17.Sánchez RojasF, Bosch Ojeda C. Recent development in derivative ultraviolet/visibleabsorption spectrophotometry: 2004–2008. Anal Chim Acta. 2009;635(1):22-44.doi:10.1016/j.aca.2008.12.039

18.Stevenson K,McVey AF, Clark IBN, Swain PS, Pilizota T. General calibration of microbialgrowth in microplate readers. Sci Rep. 2016;6(1):38828. doi:10.1038/srep38828

19.TadesseWondimkun Z. The Determination of Caffeine Level of Wolaita Zone, EthiopiaCoffee Using UV-visible Spectrophotometer. Am J Appl Chem. 2016;4(2):59. doi:10.11648/j.ajac.20160402.14

20.Yu J, Wang H,Zhan J, Huang W. Review of recent UV–Vis and infrared spectroscopy researcheson wine detection and discrimination. Appl Spectrosc Rev.2018;53(1):65-86. doi:10.1080/05704928.2017.1352511

21.Leong Y, KerP, Jamaludin M, et al. UV-Vis Spectroscopy: A New Approach for Assessing theColor Index of Transformer Insulating Oil. Sensors. 2018;18(7):2175. doi:10.3390/s18072175

22.Brown JQ,Vishwanath K, Palmer GM, Ramanujam N. Advances in quantitative UV–visiblespectroscopy for clinical and pre-clinical application in cancer. Curr OpinBiotechnol. 2009;20(1):119-131. doi:10.1016/j.copbio.2009.02.004

23.Pinheiro HM,Touraud E, Thomas O. Aromatic amines from azo dye reduction: status review withemphasis on direct UV spectrophotometric detection in textile industrywastewaters. Dyes Pigm. 2004;61(2):121-139. doi:10.1016/j.dyepig.2003.10.009

24.Kristo E,Hazizaj A, Corredig M. Structural Changes Imposed on Whey Proteins by UV Irradiationin a Continuous UV Light Reactor. J Agric Food Chem. 2012;60(24):6204-6209.doi:10.1021/jf300278k

25.Lange R, BalnyC. UV-visible derivative spectroscopy under high pressure. Biochim Biophys ActaBBA - Protein Struct Mol Enzymol. 2002;1595(1-2):80-93. doi:10.1016/S0167-4838(01)00336-3

26.Tom J, JakubecPJ, Andreas HA. Mechanisms of Enhanced Hemoglobin Electroactivity on CarbonElectrodes upon Exposure to a Water-Miscible Primary Alcohol. Anal Chem.2018;90(9):5764-5772. doi:10.1021/acs.analchem.8b00117

27.Patel MUM,Demir-Cakan R, Morcrette M, Tarascon J-M, Gaberscek M, Dominko R. Li-S BatteryAnalyzed by UV/Vis in Operando Mode. ChemSusChem. 2013;6(7):1177-1181. doi:10.1002/cssc.201300142

28.Begum R,Farooqi ZH, Naseem K, et al. Applications of UV/Vis Spectroscopy inCharacterization and Catalytic Activity of Noble Metal Nanoparticles Fabricatedin Responsive Polymer Microgels: A Review. Crit Rev Anal Chem.2018;48(6):503-516. doi:10.1080/10408347.2018.1451299

29.Behzadi S,Ghasemi F, Ghalkhani M, et al. Determination of nanoparticles using UV-Visspectra. Nanoscale. 2015;7(12):5134-5139. doi:10.1039/C4NR00580E