qPCR（或稱Real-time PCR、Real-time quantitative PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR）技術(shù)，是指在反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行絕對(duì)定量分析或者利用內(nèi)參基因進(jìn)行相對(duì)定量分析的方法。

做qPCR實(shí)驗(yàn)，目前大多數(shù)科研工作者出于實(shí)驗(yàn)需要和成本的原因會(huì)優(yōu)先考慮染料法。

染料法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，僅需2個(gè)引物，無(wú)需設(shè)計(jì)探針，初始成本低，靈敏度高。SYBR Green I是qPCR最常用的DNA結(jié)合染料，與雙鏈DNA（dsDNA）非特異性結(jié)合。在游離狀態(tài)下，SYBR Green I不發(fā)光，但一旦與dsDNA結(jié)合，其熒光大大增強(qiáng)。所以，一個(gè)反應(yīng)發(fā)出的全部熒光信號(hào)與出現(xiàn)的dsDNA量成比例，且會(huì)隨擴(kuò)增產(chǎn)物的增加而增加。

SYBR Green I染料法簡(jiǎn)單方便，但最大的缺點(diǎn)是缺乏特異性，即染料可以結(jié)合任一dsDNA。qPCR反應(yīng)中非特異性產(chǎn)物的出現(xiàn)會(huì)增加熒光值，影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，需要進(jìn)行熔解曲線分析檢驗(yàn)擴(kuò)增反應(yīng)的特異性。

什么是熔解曲線？

染料法qPCR反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)qPCR反應(yīng)體系進(jìn)行升溫，dsDNA在加溫過(guò)程中逐漸解鏈，結(jié)合的SYBR Green I逐漸析出，熒光強(qiáng)度也隨之下降。當(dāng)加熱溫度達(dá)到dsDNA的退火溫度（Tm值）時(shí)，在此溫度下，dsDNA會(huì)解鏈一半，隨后迅速解鏈，熒光信號(hào)會(huì)驟降，形成熒光信號(hào)曲線上變化的拐點(diǎn)。

對(duì)熒光信號(hào)曲線進(jìn)行負(fù)一階求導(dǎo)，就得到熔解曲線圖，熔解曲線峰值對(duì)應(yīng)的X軸的溫度，就是雙鏈DNA的Tm值。

為什么熔解曲線可以檢驗(yàn)擴(kuò)增反應(yīng)的特異性？

由于產(chǎn)物的Tm值取決于PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度，GC含量和堿基匹配狀況等原因。當(dāng)只有一個(gè)熔解曲線峰，說(shuō)明只有一種單一產(chǎn)物；但如果有兩種產(chǎn)物，長(zhǎng)度或堿基組成不一樣的話，就會(huì)產(chǎn)生兩個(gè)熔解曲線峰，即我們通常說(shuō)的雙峰。一旦產(chǎn)生雙峰，說(shuō)明擴(kuò)增反應(yīng)中存在非特異擴(kuò)增存在。

理想的熔解曲線

我們來(lái)看看，理想的熔解曲線峰圖的情況：

l 熔解曲線是平滑尖銳的單峰；

l 熔解曲線峰值對(duì)應(yīng)產(chǎn)物Tm值*；

l NTC對(duì)照不起峰。

*由于鹽離子濃度不同等原因，不同公司的反應(yīng)試劑所得的熔解曲線峰值可能略有偏差。

理想，是豐滿的~

可現(xiàn)實(shí)中，你的熔解曲線是否是這樣的？

這樣的？

或是這樣的？

關(guān)于熔解曲線，最常見(jiàn)的問(wèn)題就是雙峰或亂峰。造成熔解曲線雙峰或亂峰的原因多樣，通常為引物二聚體或非特異性擴(kuò)增、模板存在gDNA污染、試劑及環(huán)境被污染等。

但是，具體是什么原因造成的呢？NTC反應(yīng)可以幫助我們判斷哦！

NTC與熔解曲線

NTC為不含模板對(duì)照（No Template Control），即反應(yīng)體系中包含除模板以外的所有反應(yīng)組分。借助樣品反應(yīng)孔和NTC反應(yīng)孔的擴(kuò)增曲線差異，可判斷是否存在由于引物二聚體或PCR反應(yīng)產(chǎn)物引起的污染。

熔解曲線可以檢驗(yàn)擴(kuò)增反應(yīng)的特異性，因此是染料法qPCR實(shí)驗(yàn)的必需步驟（非常重要！！！）。借助熔解曲線，我們可以檢查qPCR反應(yīng)體系是否存在非特異性擴(kuò)增、引物二聚體或氣溶膠污染等。

關(guān)于qPCR實(shí)驗(yàn)，受方方面面的誤差影響真不少，一款優(yōu)秀的試劑，更是qPCR反應(yīng)成功的關(guān)鍵要素。