高效液相色譜儀HPLC保留時間不重現(xiàn)有兩種不同的情況，既保留時間漂移和保留時間波動。

    前者是指保留時間僅沿單方向發(fā)生變化，而后者指保留時間無固定規(guī)律的波動。將此兩種情況區(qū)分開來對找到問題的原因往往很有幫助。如保留時間的漂移往往由柱老化引起，而柱老化不可能引起保留時間的無規(guī)律波動。事實上，保留時間漂移的多半原因是不同機理的色譜柱老化，如固定相流失（例如通過水解），色譜柱污染（由樣品或流動相所致）等。

一 液相色譜儀分析中保留時間不重現(xiàn)的可能原因：

1 確認(rèn)流動相是否新鮮配制的，比例有無錯誤。

2 確認(rèn)色譜條件是否在色譜柱使用范圍內(nèi)，如pH范圍、溫度和壓力。

3 仔細(xì)觀察柱前壓的變化。如果壓力穩(wěn)定，可以判斷泵系統(tǒng)沒有問題。如果壓力不穩(wěn)定，通常是由于泵內(nèi)有氣泡造成的，一定會影響保留時間。將流動相仔細(xì)脫氣，并排出泵內(nèi)氣泡。

4 觀察色譜峰形和柱效變化情況，確認(rèn)色譜柱是否被污染。如果色譜柱被污染，可使用適當(dāng)溶劑沖洗。

5 如果同時伴有色譜柱柱壓升高，降低柱壓。

6 如果使用梯度洗脫，確認(rèn)平衡時間是否足夠長。流動相中使用離子對試劑（烷基磺酸鈉等）或固定相為正相硅膠等往往需要更長的平衡時間。

7 確認(rèn)樣品是否過載。

8 組分在色譜柱中保留不夠。調(diào)整色譜條件，使樣品在柱上適當(dāng)保留。

二 保留時間漂移的最常見的原因及解決方法

1、色譜柱平衡      

      如果我們觀察到保留時間漂移，首先應(yīng)考慮色譜柱是否已用流動相完全平衡。通常平衡需要10-20個柱體積的流動相，但如果在流動相中加入少量添加劑（如離子對試劑）則需要相當(dāng)長的時間來平衡色譜柱。      

      流動相污染也可能是原因之一。溶于流動相中的少量污染物可能慢慢富集到色譜柱上，從而造成保留時間的漂移。應(yīng)注意：水是很容易污染的流動相成分。  

2、固定相穩(wěn)定性     

     固定相的穩(wěn)定性都是有限的，即使在推薦的PH范圍內(nèi)使用，固定相也會慢慢水解。例如硅膠基質(zhì)在pH4時水解穩(wěn)定性最好。水解速度與流動相類型和配體有關(guān)。雙官能團配體和三官能團配體比單官能團配體的鍵合相要穩(wěn)定；長鏈鍵合相比短鏈鍵合相穩(wěn)定；烷基鍵合相比氰基鍵合相穩(wěn)定的多。      

     經(jīng)常清洗色譜柱亦會加速色譜柱固定相的水解。其他硅膠基質(zhì)鍵合相在水溶液環(huán)境中也可以發(fā)生水解，如氨基鍵合相等。

3、色譜柱污染     

     保留時間漂移的另一個常見原因是色譜柱污染。HPLC色譜柱是非常有效的吸附性過濾器，它可以過濾并吸附流動相攜帶的任何物質(zhì)。

      污染源可以是流動相本身，流動相容器，連接管、泵、進(jìn)樣器和儀器密封墊，以及樣品等。通常通過實驗可判斷污染的來源。

      樣品中如果存在色譜柱上保留很強的組分，就可能是使保留時間漂移的潛在根源。這些根源通常是樣品基質(zhì)。避免色譜柱污染最簡單的方法是防患于未然。通常使用在給定色譜條件下的強溶劑，但并非所有污染物都可以在流動相中溶解。使用保護(hù)柱是個非常有效的方法。反沖色譜柱僅是不得已時采用的辦法。    

4、流動相組成

      流動相組成的緩慢變化也是保留時間漂移的常見原因。如流動相中易揮發(fā)組分的揮發(fā)及循環(huán)使用流動相等。    

5、疏水坍塌      

      當(dāng)小孔徑、端基封口良好的反相填料色譜柱使用接近100%的水為流動相時，有時會發(fā)生分離突然喪失及被分析物質(zhì)保留明顯降低或完全不保留的現(xiàn)象，這就是疏水坍塌。此現(xiàn)象是由流動相不浸潤固定相表面而致。挽救的辦法實現(xiàn)用含大量有機組分的流動相浸潤固定相，再用高水含量的流動相進(jìn)行平衡。色譜柱長期儲存也會發(fā)生此現(xiàn)象。使用內(nèi)嵌極性基團的反相色譜柱（如Waters  SymmetryShield RP色譜柱） 或非端基封口的色譜柱（如Waters  Resolve色譜柱）也可避免發(fā)生坍塌。