7月2日，國家藥品監督管理局、國家衛生健康委發布公告，正式頒布2020年版《中國藥典》，新版藥典將于今年12月30日起正式實施。新版《中國藥典》中對非無菌產品的微生物限度及檢查方法等都做出了相關要求，本文對其要點進行了整理，供大家參考。

供試品檢查

供試品的控制菌檢查應按經方法適用性試驗確認的方法進行。

（1）陽性對照試驗

陽性對照試驗方法同供試品的控制菌檢查，對照菌的加量應不大于100cfu。陽性對照試驗應檢出相應的控制菌。

（2）陰性對照試驗

以稀釋劑代替供試液照相應控制菌檢查法檢查，陰性對照試驗應無菌生長。如果陰性對照有菌生長，應進行偏差調查。

耐膽鹽革蘭陰性菌（Bile-Tolerant  Gram-Negative  Bacteria）

（1）供試液制備和預培養

取供試品，用胰酪大豆胨液體培養基作為稀釋劑照“非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法（通則1105）”制成1∶10供試液，混勻，在20～25℃培養，培養時間應使供試品中的細菌充分恢復但不增殖（約2小時）。

（2）定性試驗

除另有規定外，取相當于1g或1ml供試品的上述預培養物接種至適宜體積（經方法適用性試驗確定）腸道菌增菌液體培養基中，30～35℃培養24～48小時后，劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基平板上，30～35℃培養18～24小時。如果平板上無菌落生長，判供試品未檢出耐膽鹽革蘭陰性菌。

（3）定量試驗

1）選擇和分離培養

取相當于0.1g、0.01g和0.001g（或0.1ml、0.01ml和0.001ml）供試品的預培養物或其稀釋液分別接種至適宜體積（經方法適用性試驗確定）腸道菌增菌液體培養基中，30～35℃培養24～48小時。上述每一培養物分別劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基平板上，30～35℃培養18～24小時。

2）結果判斷

若紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基平板上有菌落生長，則對應培養管為陽性，否則為陰性。根據各培養管檢查結果，從表2查1g或1ml供試品中含有耐膽鹽革蘭陰性菌的可能菌數。

大腸埃希菌（Escherichia  coli ）

（1）供試液制備和增菌培養

取供試品，照“非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法（通則1105）”制成1∶10供試液。取相當于1g或1ml供試品的供試液，接種至適宜體積（經方法適用性試驗確定）的胰酪大豆胨液體培養基中，混勻，30～35℃培養18～24小時。

（2）選擇和分離培養

取上述培養物1ml接種至100ml麥康凱液體培養基中，42～44℃培養24～48小時。取麥康凱液體培養物劃線接種于麥康凱瓊脂培養基平板上，30～35℃培養18～72小時。

（3）結果判斷  

若麥康凱瓊脂培養基平板上有菌落生長，應進行分離、純化及適宜的鑒定試驗，確證是否為大腸埃希菌；若麥康凱瓊脂培養基平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結果為陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌。

沙門菌（Salmonella）

（1）供試液制備和增菌培養

取10g或10ml供試品直接或處理后接種至適宜體積（經方法適用性試驗確定）的胰酪大豆胨液體培養基中，混勻，30～35℃培養18～24小時。

（2）選擇和分離培養

取上述培養物0.1ml接種至10ml RV沙門菌增菌液體培養基中，30～35℃培養18～24小時。取少量RV沙門菌增菌液體培養物劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基平板上，30～35℃培養18～48小時。

沙門菌在木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基平板上生長良好，菌落為淡紅色或無色、透明或半透明、中心有或無黑色。

用接種針挑選疑似菌落于三糖鐵瓊脂培養基高層斜面上進行斜面和高層穿刺接種，培養18～24小時，或采用其他適宜方法進一步鑒定。

（3）結果判斷  

1）若木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基平板上有疑似菌落生長，且三糖鐵瓊脂培養基的斜面為紅色、底層為黃色，或斜面黃色、底層黃色或黑色，應進一步進行適宜的鑒定試驗，確證是否為沙門菌。

2）如果平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結果為陰性，或三糖鐵瓊脂培養基的斜面未見紅色、底層未見黃色；或斜面黃色、底層未見黃色或黑色，判供試品未檢出沙門菌。

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）

（1）供試液制備和增菌培養

取供試品，照“非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法（通則1105）”制成1∶10供試液。取相當于1g或1ml供試品的供試液，接種至適宜體積（經方法適用性試驗確定的）的胰酪大豆胨液體培養基中，混勻，30～35℃培養18～24小時。

（2）選擇和分離培養

1）取上述培養物劃線接種于溴化十六烷基三甲鏤瓊脂培養基平板上，30～35℃培養18～72小時。

2）取上述平板上生長的菌落進行氧化酶試驗，或釆用其他適宜方法進一步鑒定。

（3）氧化酶試驗

將潔凈濾紙片置于平皿內，用無菌玻棒取上述平板上生長的菌落涂于濾紙片上，滴加新配制的1%二鹽酸N，N-二甲基對苯二胺試液，在30秒內若培養物呈粉紅色并逐漸變為紫紅色為氧化酶試驗陽性，否則為陰性。

（4）結果判斷

1）若溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基平板上有菌落生長，且氧化酶試驗陽性，應進一步進行適宜的鑒定試驗，確證是否為銅綠假單胞菌。

2）如果平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結果為陰性，或氧化酶試驗陰性，判供試品未檢出銅綠假單胞菌。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus  aureus）

（1）供試液制備和增菌培養

取供試品，照“非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法（通則1105）”制成1∶10供試液。取相當于1g或1ml供試品的供試液，接種至適宜體積（經方法適用性試驗確定）的胰酪大豆胨液體培養基中，混勻，30～35℃培養18～24小時。

（2）選擇和分離培養

取上述培養物劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養基平板上，30～35℃培養18～72小時。

（3）結果判斷

若甘露醇氯化鈉瓊脂培養基平板上有黃色菌落或外周有黃色環的白色菌落生長，應進行分離、純化及適宜的鑒定試驗，確證是否為金黃色葡萄球菌；若平板上沒有與上述形態特征相符或疑似的菌落生長，或雖有相符或疑似的菌落生長但鑒定結果為陰性，判供試品未檢出金黃色葡萄球菌。

梭菌（Clostridia）

（1）供試液制備和熱處理

取供試品，照“非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法（通則1105）”制成1∶10供試液。取相當于1g或1ml供試品的供試液2份，其中1份置80℃保溫10分鐘后迅速冷卻。

（2）增菌、選擇和分離培養

1）將上述2份供試液分別接種至適宜體積（經方法適用性試驗確定）的梭菌增菌培養基中，置厭氧條件下30～35℃培養48小時。

2）取上述每一培養物少量，分別涂抹接種于哥倫比亞瓊脂培養基平板上，置厭氧條件下30～35℃培養48～72小時。

（3）過氧化氫酶試驗

取上述平板上生長的菌落，置潔凈玻片上，滴加3%過氧化氫試液，若菌落表面有氣泡產生，為過氧化氫酶試驗陽性，否則為陰性。

（4）結果判斷

1）若哥倫比亞瓊脂培養基平板上有厭氧桿菌生長（有或無芽孢），且過氧化氫酶反應陰性的，應進一步進行適宜的鑒定試驗，確證是否為梭菌.

2）如果哥倫比亞瓊脂培養基平板上沒有厭氧桿菌生長，或雖有相符或疑似的菌落生長但鑒定結果為陰性，或過氧化氫酶反應陽性，判供試品未檢出梭菌。

白色念珠菌（Candida albicans）

（1）供試液制備和增菌培養  

取供試品，照“非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法（通則1105）”制成1∶10供試液。取相當于1g或1ml供試品的供試液，接種至適宜體積（經方法適用性試驗確定）的沙氏葡萄糖液體培養基中，混勻，30～35℃培養3～5天。

（2）選擇和分離

1）取上述預培養物劃線接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養基平板上，30～35℃培養24～48小時。

2）白色念珠菌在沙氏葡萄糖瓊脂培養基上生長的菌落呈乳白色，偶見淡黃色，表面光滑有濃酵母氣味，培養時間稍久則菌落增大，顏色變深、質地變硬或有皺褶。

3）挑取疑似菌落接種至念珠菌顯色培養基平板上，培養24～48小時（必要時延長至72小時），或釆用其他適宜方法進一步鑒定。

（3）結果判斷

1）若沙氏葡萄糖瓊脂培養基平板上有疑似菌落生長，且疑似菌在念珠菌顯色培養基平板上生長的菌落呈陽性反應，應進一步進行適宜的鑒定試驗，確證是否為白色念珠菌。

2）若沙氏葡萄糖瓊脂培養基平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結果為陰性，或疑似菌在念珠菌顯色培養基平板上生長的菌落呈陰性反應，判供試品未檢出白色念珠菌。