2019新型冠狀病毒抗原/抗體檢測試劑注冊技術審評要點（試行）

 

本要點旨在指導注冊申請人對2019新型冠狀病毒抗原/抗體檢測試劑注冊申報資料的準備及撰寫，同時也為技術審評部門審評注冊申報資料提供參考。

本要點是對2019新型冠狀病毒抗原/抗體檢測試劑的一般要求，申請人應依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應的科學依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對注冊申報資料的內(nèi)容進行充實和細化。

一、適用范圍

本審評要點適用于2019新型冠狀病毒抗原/抗體檢測試劑，試劑用于對血清、血漿、全血、咽拭子、肺泡灌洗液、痰液或其他呼吸道分泌物等樣本中的2019新型冠狀病毒抗原/抗體進行體外定性檢測。本審評要點適用于進行首次注冊申報的產(chǎn)品。

二、性能評估

企業(yè)應提交在符合質(zhì)量管理體系的生產(chǎn)環(huán)境下生產(chǎn)的試劑盒進行的所有性能評估驗證的研究資料，包括具體研究方法、實驗方案、實驗數(shù)據(jù)、統(tǒng)計分析等詳細資料。建議著重對以下分析性能進行研究。

1. 樣本采集和處理

（1）研究樣本采集時間點的選擇：是否受病程、臨床癥狀、用藥情況等因素的影響。

（2）針對拭子樣本，研究對采樣拭子及樣本保存液（采樣液）等的要求：對采樣拭子的材質(zhì)要求（包括對拭子頭和拭子桿的要求）、保存容器要求，保存液（采樣液等）成分、濃度、使用量的要求等。

（3）針對血液樣本，研究適用的抗凝劑。

2. 最低檢測限

（1）最低檢測限的確定

抗體檢測：建議選取特定滴度的特異性抗體陽性樣本梯度稀釋進行最低檢測限確定，每個梯度的稀釋液重復3～5份，每份稀釋液重復檢測不少于20次，將具有90%～95%陽性檢出率的抗體水平作為最低檢測限，抗體滴度應采用適宜的方法進行確認。

抗原檢測：建議對病毒進行梯度稀釋后研究確定最低檢測限，每個梯度的病毒稀釋液重復3～5份，每份稀釋液重復檢測不少于20次，將具有90%～95%陽性檢出率的病毒水平作為最低檢測限，抗原濃度應采用適宜的方法進行確認。

抗原、IgM抗體、IgG抗體應分別選擇不同來源具有代表性的3個臨床樣本或培養(yǎng)后病毒原液進行最低檢測限的確定。

（2）最低檢測限的驗證

選擇具有時間和區(qū)域特征性的至少3個病毒株或臨床樣本（與最低檢測限確定不同樣本）在最低檢測限濃度水平進行驗證，應達到90%～95%陽性檢出率。

采用的稀釋液應與適用樣本類型的基質(zhì)一致，可采用陰性樣本進行稀釋。抗原檢測試劑應提供詳細的病毒滴度的確定方法，同時應詳細描述病毒樣本的確認方法及驗證結果。抗體檢測試劑應提供詳細的抗體類型和滴度的確認方法及驗證結果。

3.不同區(qū)域病毒樣本包容性的驗證

提供具有時間和區(qū)域特征性的不同來源的患者真實臨床樣本進行驗證，抗原、IgM抗體、IgG抗體檢測試劑分別研究各10個不同患者樣本，驗證內(nèi)容應包括最低檢出限、重復性等，提供樣本及濃度的確認方法、實驗數(shù)據(jù)。

4. 分析特異性

（1）交叉反應驗證（抗原、IgM抗體、IgG抗體檢測試劑應分別驗證）

①地方性人類冠狀病毒（HKU1，OC43，NL63和229E）；

②H1N1（新型甲型H1N1流感病毒（2009）、季節(jié)性H1N1流感病毒）、H3N2、H5N1、H7N9，乙型流感Yamagata、Victoria，呼吸道合胞病毒，鼻病毒A、B、C組，腺病毒1、2、3、4、5、7、55型，腸病毒A、B、C、D組，EB病毒、麻疹病毒、人巨細胞病毒、輪狀病毒、諾如病毒、腮腺炎病毒、水痘-帶狀皰疹病毒；

③肺炎支原體。

提供所有用于交叉反應驗證的病原體、抗體等樣本的來源、陰陽性、種屬/型別和濃度/滴度確認等試驗資料。抗原檢測試劑建議在病毒等的醫(yī)學相關水平進行交叉反應的驗證，如病毒濃度為10⁵ pfu/mL或更高。

④高濃度新型冠狀病毒特異性IgG抗體與特異性IgM抗體的交叉反應驗證。

⑤驗證不少于20份正常人樣本。

（2）內(nèi)源/外源物質(zhì)干擾

不同樣本類型其潛在干擾物質(zhì)可能不同，應根據(jù)具體采集的樣本類型，選擇適用的干擾物質(zhì)進行研究。建議申請人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度（“最差條件”）條件下進行評價，在病毒抗原、抗體臨界陽性水平進行干擾試驗驗證。

表1 推薦用于干擾試驗的物質(zhì)

物質(zhì)	活性成分
粘蛋白	純化粘蛋白
血液中	膽紅素、血脂、血紅蛋白、類風濕因子、抗核抗體、抗線粒體抗體、HAMA、總IgG、總IgM、紅細胞壓積（全血樣本適用）、高濃度新型冠狀病毒特異性IgG抗體與特異性IgM抗體的干擾等。
血液
抗病毒藥物	α-干擾素、扎那米韋、利巴韋林、奧司他韋、帕拉米韋、洛匹那韋、利托那韋 阿比多爾
抗生素	左氧氟沙星 阿奇霉素 頭孢曲松 美羅培南
全身性抗菌藥	妥布霉素
過敏性癥狀緩解藥物	鹽酸組胺
鼻腔噴霧劑或滴鼻劑	苯福林、羥甲唑啉、氯化鈉（含防腐劑）
鼻用皮膚類固醇	倍氯美松、地塞米松、氟尼縮松、曲安奈德、布地奈德、莫米松、氟替卡松

5.IgM抗體檢測試劑：對至少5份含有病原體特異性IgM抗體的樣本進行IgM破壞實驗研究，方法為采用特定的化學制劑（如2－巰基乙醇或二硫蘇糖醇）處理樣本后，重新進行檢測，IgM檢測結果應為陰性。

6.精密度

企業(yè)應對精密度指標，如標準差或變異系數(shù)等的評價標準做出合理要求。模擬樣本并不能體現(xiàn)臨床樣本可能帶來的所有變異因素，因此精密度評價中應同時包含若干臨床樣本。針對本類產(chǎn)品的精密度評價主要包括以下要求。

（1）對可能影響檢測精密度的主要變量進行驗證，應對檢測時間、分析儀、操作者、地點、檢測輪次等要素進行相關的驗證。

（2）設定合理的精密度評價周期，例如：為期至少20天或5天的檢測，具體方案可參考EP文件進行。從而對批內(nèi)/批間、日內(nèi)/日間以及不同操作者之間的精密度進行綜合評價。

（3）用于精密度評價的臨床樣本應至少包含3個水平：陰性樣本、臨界陽性樣本、（中或強）陽性樣本，并根據(jù)產(chǎn)品特性設定適當?shù)木芏纫蟆?/span>

①陰性樣本：待測物濃度低于最低檢測限或為零濃度，陰性檢出率應為100%（n≥20）。

②臨界陽性樣本：待測物濃度略高于試劑盒的最低檢測限，陽性檢出率應≥95%（n≥20）。

③中/強陽性樣本：待測物濃度呈中度到強陽性，陽性檢出率為100%且CV≤15%（n≥20）。

7.鉤狀（HOOK）效應研究。

8.提供企業(yè)參考品驗證資料：根據(jù)主要原材料研究資料中的企業(yè)參考品設置情況，采用三批產(chǎn)品對企業(yè)參考品進行檢驗并提供詳細的實驗數(shù)據(jù)。

9.其他需注意問題

如使用儀器進行結果判讀的產(chǎn)品，應提供產(chǎn)品說明書【適用機型】項中所列的所有型號儀器的性能評估資料。

10.適用的樣本類型

如產(chǎn)品適用于血清和血漿，可采用同源比對驗證樣本的可比性。

如產(chǎn)品適用于全血，可采用該樣本類型進行全性能評估，亦可至少進行最低檢測限、不同區(qū)域病毒樣本的包容性和精密度研究，同時進行同源比對試驗。

三、注冊檢驗

應提供符合產(chǎn)品技術要求的、在具有相應醫(yī)療器械檢驗資質(zhì)和承檢范圍的醫(yī)療器械檢驗機構進行的產(chǎn)品檢驗報告，應提供連續(xù)3個生產(chǎn)批次樣品的檢驗合格報告。

該項目尚無國家參考品，應使用企業(yè)參考品進行注冊檢驗，如發(fā)布應急用國家參考品，應采用國家參考品進行注冊檢測。

四、陽性判斷值確定資料

提交對申報試劑陰性/灰區(qū)/陽性等結果判斷的陽性判斷值（cut-off,CO）確定的研究資料，包括具體的試驗方案、人群及受試者樣本選擇、評價標準、統(tǒng)計學分析和研究數(shù)據(jù)等。建立陽性判斷值使用的樣本來源的選擇應考慮到不同的地理區(qū)域、不同的感染階段和生理狀態(tài)等因素的影響。另外，明確不同的樣本類型是否有差異，如有差異應分別確定。

如適用,可采用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve, ROC）的分析方式來選擇確定合理的陽性判斷值；如結果存在灰區(qū)（equivocal zone），應明確灰區(qū)建立的基礎。如采用其他方法對陽性判斷值進行確認研究，應說明這種方法的合理性。

五、主要原材料研究資料

此產(chǎn)品的主要原材料包括抗原、抗體、質(zhì)控品、參考品等。應提供主要原材料的選擇與來源、制備過程、質(zhì)量標準等相關研究資料。如主要原材料為企業(yè)自制，應提供其詳細制備過程；如主要原材料源于外購，應提供資料包括：選擇該原材料的依據(jù)及對比篩選試驗資料、供應商提供的質(zhì)量標準、出廠檢驗報告，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗資料，供應商應固定，不得隨意更換。申請人應對各主要原材料均明確質(zhì)量控制標準。

1. 新型冠狀病毒特異的抗原、抗體

病原體特異的抗原、抗體是該類產(chǎn)品的關鍵原材料。由于新型冠狀病毒不同地域、不同人群感染的毒株之間存在的差異尚未明確，因此在選擇抗原、抗體原料時，應注重抗原表位的選擇，避免毒株間差異造成的假陰性，亦應考慮抗原在其他冠狀病毒的表達情況，避免存在交叉反應出現(xiàn)假陽性。抗原、抗體原材料研究資料中應詳述該方面的考慮。

（1）新型冠狀病毒抗體檢測試劑所用特異性抗原

首先應詳述抗原表位及選擇依據(jù)，此外應提交抗原來源、制備、篩選、純化、鑒定及質(zhì)量標準（外觀、蛋白濃度、純度、分子量、功能性試驗等）等詳細試驗資料。

主要包括以下兩種情況：

• 企業(yè)自制抗原

如為天然抗原，則應對毒株選擇、培養(yǎng)、抗原提取、純化、鑒定等實驗過程予以詳述。如為重組抗原，則應提交有關特定基因選擇、序列信息，克隆構建及轉化，抗原表達及純化、鑒定等詳細資料。

• 企業(yè)外購抗原

應詳述抗原的名稱，抗原生物學來源，供應商名稱，提交供應商選擇的研究資料及供應商出具的抗原性能指標及檢驗報告。

（2）新型冠狀病毒抗原檢測試劑所用特異性抗體

首先應詳述抗體所針對的抗原表位、抗體制備所用免疫原以及確定該抗體作為主要原材料的依據(jù)，此外應提交抗體來源、制備、篩選、鑒定及質(zhì)量標準（外觀、蛋白濃度、純度、分子量、效價、功能性試驗等）等詳細試驗資料。

主要包括以下兩種情況：

• 企業(yè)自制抗體

如使用天然抗原作為免疫原，應提供該天然抗原的來源；如使用重組抗原或其他人工合成抗原作為免疫原，應提供相應的核酸或者蛋白序列信息。針對抗體的制備、鑒定等過程，應提交詳細的研究資料和工藝穩(wěn)定性驗證資料。

• 企業(yè)外購抗體

應詳述抗體的名稱及生物學來源，供應商名稱；提交供應商選擇的研究資料及供應商出具的抗體性能指標及檢驗報告。

2. 其他主要原輔料

除上述主要原材料外，產(chǎn)品中包含的其他主要原輔料，如小鼠抗人IgM/IgG單克隆抗體、酶標抗體、膠體金、硝酸纖維素膜、微孔板、樣本稀釋液等，均應進行選擇及驗證，并提交相關資料。明確主要原輔料的供應商和質(zhì)量控制標準。免疫層析方法學的產(chǎn)品如適用于全血，應介紹血細胞去除方式，并驗證去除效果。

3.試劑盒質(zhì)控品/質(zhì)控線

產(chǎn)品應設置合理的質(zhì)控品/質(zhì)控線。質(zhì)控品應至少包含陰性和陽性兩個水平。抗原檢測試劑陽性質(zhì)控品可選擇滅活的病毒株或臨床陽性樣本，亦可選擇假病毒。抗體檢測試劑陽性質(zhì)控品可選擇臨床陽性樣本，陰性質(zhì)控品可選擇臨床陰性樣本或陰性基質(zhì)等。提交相關原料的來源、選擇和性能確認等相關研究資料，明確供應商和質(zhì)量控制標準。企業(yè)應對質(zhì)控品的檢測結果（如A值）做出明確的范圍要求（試驗有效性的判斷）。

 4.企業(yè)參考品

如申報產(chǎn)品有相應的國家參考品，則企業(yè)參考品應參考國家參考品的項目設置，應不低于國家參考品要求。若尚無國家參考品，申請人應根據(jù)產(chǎn)品性能驗證的實際情況自行設定企業(yè)參考品。

應提交企業(yè)參考品的原料來源、選擇、制備、陰陽性及濃度/滴度確認方法或試劑等相關驗證資料。企業(yè)參考品的基質(zhì)應與待測樣本相同。新型冠狀病毒抗體/抗原檢測試劑的企業(yè)參考品的設置建議如下：

（1）陽性參考品

陽性參考品應考慮覆蓋不同來源及特征的新型冠狀病毒感染樣本，可選擇至少各5份確認為陽性的臨床樣本，并設置不同滴度水平。

（2）陰性參考品

陰性參考品應考慮檢測特異性的評價，應納入正常臨床樣本、含類風濕因子等干擾因素的樣本及其他病原體特異性抗體、抗原陽性樣本，建議包括冠狀病毒（HKU1、OC43、NL63、229E）、SARS冠狀病毒（抗體檢測可不包括）、MERS冠狀病毒（抗體檢測可不包括）、流感病毒、腸道病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等抗體/抗原陽性樣本。

（3）檢測限參考品

可設置臨床陽性樣本的系列稀釋樣本，其中應包含檢測限水平。

（4）重復性參考品

建議包括高、低兩個濃度的臨床樣本，其中一個濃度應為最低檢出限附近的濃度。

六、主要生產(chǎn)工藝及反應體系的研究資料

1.產(chǎn)品基本反應原理介紹。

2.主要生產(chǎn)工藝介紹，可用流程圖方式表示，并簡要說明主要生產(chǎn)工藝的確定依據(jù)。

3.包被/標記工藝研究，申請人應考慮如包被/標記液量、濃度、時間、條件等指標對產(chǎn)品性能的影響，通過實驗確定上述指標的最佳組合。

4.顯色系統(tǒng)、酶作用底物等的介紹以及最適條件研究。

5.反應條件確定：申請人應考慮反應時間、判讀時間、反應溫度、洗滌液體積和洗滌次數(shù)（如涉及）等條件對產(chǎn)品性能的影響，通過實驗確定上述條件的最佳組合。

6.反應體系中樣品加樣方式及加樣量確定：通過實驗確定最佳的加樣方式及加樣量。如樣本需采取稀釋或其他必要的方法進行處理后方可用于最終檢測，申請人還應對樣本稀釋液及其用量、其他必要的處理方法等進行研究。對于IgM抗體檢測試劑，如采用間接法，建議考慮高濃度特異性IgG對結果的影響，合理設置IgG去除相關樣本處理步驟，以降低特異性IgG可能造成的假陰性和假陽性。

七、穩(wěn)定性研究資料

穩(wěn)定性研究資料主要涉及兩部分內(nèi)容，申報試劑的穩(wěn)定性和適用樣本的穩(wěn)定性研究。

1.申報試劑的穩(wěn)定性主要包括實時穩(wěn)定性（有效期）、開瓶（開封）穩(wěn)定性、高溫加速破壞穩(wěn)定性、運輸穩(wěn)定性等研究，申請人可根據(jù)實際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應包括研究方法的確定依據(jù)、具體的實施方案、詳細的研究數(shù)據(jù)以及結論。對于實時穩(wěn)定性研究，應提供至少三批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

2.適用樣本的穩(wěn)定性

申請人應對樣本穩(wěn)定性進行合理的驗證，主要是對冷藏和冷凍兩種條件下的有效期進行驗證。可以在合理的溫度范圍內(nèi)，每間隔一定的時間段即對儲存樣本進行驗證，從而確認不同類型樣本的穩(wěn)定性。如樣本采集后需加入保存液（采樣液等），應同時對處理后的樣本進行樣本穩(wěn)定性的研究。

另外，如果采用加熱后樣本（如熱滅活）進行檢測，則應對加熱前后的病原體特異性IgM抗體陽性樣本進行加熱因素的干擾驗證，方法為對臨界值附近的至少5份弱陽性加熱和未加熱樣本進行對比檢測，比較檢測結果的差異。

八、臨床證據(jù)

新型冠狀病毒抗原/抗體檢測試劑臨床試驗應按要求在三家以上臨床試驗機構進行（含各級疾病預防控制中心），采用試驗用體外診斷試劑與可獲得的臨床參考標準進行比較研究，從而對產(chǎn)品臨床性能進行確認。如臨床試驗機構條件允許，推薦多家生產(chǎn)企業(yè)的試劑盒在相同的臨床試驗機構共同驗證。

1.臨床參考標準的確定

進入應急審批的新型冠狀病毒抗原/抗體檢測試劑，其預期用途一般為新型冠狀病毒感染的肺炎的輔助診斷，則臨床試驗中應選擇臨床上新型冠狀病毒感染的肺炎診斷標準及疾病進程的判定結果作為對比方法進行比較研究。國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布的《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》等文件明確了新型冠狀病毒感染的肺炎診斷標準。建議同時參考診斷所用核酸檢測結果，以利于抗原、抗體檢測試劑臨床性能的充分評價。

2.臨床試驗入組人群

臨床試驗的入組人群應為產(chǎn)品的預期適用人群，該產(chǎn)品的適用人群為新型冠狀病毒感染肺炎的疑似病例。有關“疑似病例”的定義，參照現(xiàn)行有效的《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》執(zhí)行。

臨床試驗的入組人群應能夠代表產(chǎn)品適用人群的各種類型，包括新型冠狀病毒感染的肺炎確診病例（包括部分恢復期病例）、排除病例等。

其中確診病例應包括不同疾病進程的患者（如發(fā)病初期、中期、治療后期/恢復期患者等）。

此外還應納入部分新型冠狀病毒感染的肺炎患者不同時間采集的連續(xù)樣本，包含該病例新型冠狀病毒核酸和抗原/抗體由陰性轉為陽性的各階段樣本。

3.臨床試驗樣本類型

新型冠狀病毒抗體檢測試劑適用的樣本類型一般包括血清、血漿、全血，新型冠狀病毒抗原檢測試劑適用的樣本類型一般包括咽拭子等呼吸道樣本，試劑盒樣本采集建議按照《新型冠狀病毒感染的肺炎實驗室檢測技術指南》進行。

對于不同的樣本類型，如臨床前研究證實檢測性能沒有差異（如血清、血漿樣本檢測性能沒有差異），則臨床試驗中可匯總統(tǒng)計,或進行同源樣本比對；其他情形下，不同樣本類型建議分別進行統(tǒng)計分析，并分別滿足例數(shù)要求，如匯總統(tǒng)計應有充分的依據(jù)。

4.臨床試驗樣本量

目前研發(fā)的新型冠狀病毒抗原/抗體檢測試劑一般為定性檢測產(chǎn)品，臨床試驗過程中建議根據(jù)預設的臨床評價指標如臨床靈敏度、臨床特異度以及相關的統(tǒng)計學參數(shù)采用合理的統(tǒng)計模型對最低樣本量進行估算。其中臨床評價指標的確定應依據(jù)該產(chǎn)品前期研究情況確定。例如，預期臨床靈敏度為85%，按照抽樣精度公式估算確診病例應不少于200例；預期特異度可達到95%，根據(jù)臨床對此類檢測試劑的特異度要求，設定特異度目標值90%，按照目標值法公式估算，排除病例建議不少于300例。其中確診病例應包含一定數(shù)量恢復期病例。申請人可依據(jù)產(chǎn)品的具體特點進行相應的樣本量估算。

為了對產(chǎn)品的臨床性能進行更加科學和全面的評價，入組病例中不同病程階段的患者均應有一定的例數(shù)。必要時各重要亞組的樣本量應分別達到統(tǒng)計學要求。

5.臨床試驗結果的統(tǒng)計分析

此類產(chǎn)品的臨床試驗目的在于驗證申報產(chǎn)品與臨床參考標準的一致性，統(tǒng)計分析一般以2×2表的形式對結果進行總結，并據(jù)此計算臨床靈敏度、臨床特異度及其置信區(qū)間。

針對有新型冠狀病毒感染的確診/排除結論的病例，應以臨床診斷標準為對照，按照如上方法評價試驗用體外診斷試劑的臨床靈敏度和特異度。同時，針對不同病程階段的患者進行分層分析。臨床性能的綜合評價指標及各亞組評價指標均應滿足臨床對此類檢測試劑的要求。

針對新型冠狀病毒感染的肺炎患者不同時間采集的連續(xù)樣本，應同時對比核酸檢測結果，評價試驗用體外診斷試劑對新型冠狀病毒感染的檢出能力和窗口期。

為評價IgG和IgM聯(lián)合檢測的臨床意義，除針對IgG和IgM檢測結果進行分別統(tǒng)計外，還應進行兩項指標綜合評價的統(tǒng)計分析。

臨床試驗中所有不一致結果均應結合患者的流行病學背景、臨床癥狀、疾病轉歸等信息進行充分的分析。

6. 臨床證據(jù)的形式要求

申請人應按照《體外診斷試劑注冊管理辦法》、《關于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式的公告》等法規(guī)文件要求提交各機構倫理審查意見、臨床試驗方案和臨床試驗報告以及臨床試驗總結報告。

臨床試驗數(shù)據(jù)匯總表作為臨床試驗報告的附件提交。數(shù)據(jù)表中應包括檢測病例的編號、年齡、性別、樣本類型、采集時間、臨床診斷背景信息、本產(chǎn)品檢測結果及新型冠狀病毒感染的確診或排除結果等，同時請明確疾病確診所采用的核酸檢測結果（包括核酸檢測試劑名稱）。臨床應用的數(shù)據(jù)集中每一病例編號應能夠溯源。鑒于抗原、抗體的產(chǎn)生與病原體感染病程密切相關，建議在臨床背景信息中詳述患者發(fā)病時間、癥狀變化、疾病轉歸等（具體要求參見附表）。

受試者編號	年齡	性別	樣本類型	確診/排除 結果	臨床診斷背景信息	考核試劑檢測結果	核酸檢測結果	采樣時間
備注： a）原則上每個病例均應明確確診/排除結果，如有核酸檢測為陰性且具有肺炎影像學特征，無法排除的病例應在確診/排除結果一欄特別注明。 b）確診病例應明確采樣時間點的病程階段：初期、中期或治療后期/恢復期等。 c）受試者編號應唯一可溯源。