提示 

藥物雜質是指任何影響藥物純度的物質,它是反映藥物質量的重要指標。藥物中的雜質一方面導致藥物活性成分含量降低,影響藥物的治療效果;另一方面毒性雜質在用藥過程中會威脅人類的健康。因此必須選擇合適的分析技術進行研究,確定其來源,并對其結構進行鑒定。液質聯用技術靈敏度高、專屬性強、重現性好,能提供豐富的結構信息,是目前藥物雜質結構鑒定分析領域應用最為廣泛的一種技術。本文對近年來液質聯用技術在抗生素藥物、喹諾酮類藥物、沙坦類藥物及其他藥物中雜質的結構鑒定方面進行綜述,并對其發展趨勢進行展望。

任何影響藥物純度的物質統稱為雜質。藥物中含有雜質會降低療效和影響穩定性,有的甚至對人體健康有害或產生其他不良反應。因此,對雜質進行檢測,鑒定其可能的結構,分析其來源,對控制藥物質量至關重要。藥品研究者、生產者應盡可能地明確藥品中各類雜質的結構、來源、毒性、檢測方法以及質控限度。按人用藥物注冊技術要求國際協調會(ICH)要求,對原料藥中含量大于0.1%的雜質需要進行結構鑒定。能否快速地鑒別出藥物中雜質的結構,關系到“雜質譜控制”理念應用的成敗[3],也是當代藥物分析中的重要內容之一。

液相色譜-質譜聯用技術(LC-MS)是20世紀70 年代發展起來的一門新的儀器分析方法,是一種以液相色譜為主要分離手段,質譜法作為檢測手段的色譜檢測技術,集合了液相色譜儀(LC)的高分離能力和質譜儀(MS)的高靈敏度、高專屬性的特點,簡化了復雜混合物的分離純化過程。液質聯用技術已經成為藥物中微量雜質分析的首選技術,特別是多級質譜和高分辨質譜的發展和應用,能夠在線獲得化合物的豐富片段信息和分析組成信息,可根據一級、二級甚至多級質譜信息確定化合物的分子量并推斷出可能分子結構,為藥物雜質的結構鑒定提供快速、準確的方法。近二十年來,隨著液質聯用技術發展的日臻完善,其在藥物雜質結構鑒定研究中的應用也越來越廣泛,展現出廣闊的應用前景。本文對近年來液質聯用技術在抗生素藥物、喹諾酮類藥物、沙坦類藥物及其他藥物中雜質的結構鑒定方面的研究進行綜述,對其鑒定出的雜質進行歸類總結。

1、β-內酰胺類藥

β-內酰胺類藥物一般由微生物發酵產生并經純化、精制以及化學修飾等過程制得,主要分為青霉素類、頭孢菌素類等典型的β-內酰胺和非典型內酰胺如青霉烯、氧頭孢、碳頭孢、單環內酰胺等,這些抗生素的分子結構中均含有β-內酰胺環。分析β-內酰胺類抗生素的雜質結構應首先推測其雜質來源。可根據產品的生產工藝、反應條件,以及各種起始物、中間體和終產物的理化性質,推測產品中可能出現的各種雜質;也可設計加速試驗或強制降解試驗如熱、酸、堿、氧化、光照等,使藥物發生降解,再進行相關的儀器分析。

了解藥物的MS裂解規律,有助于對雜質結構的推測。雖然不同儀器和不同離子化方式所得到的碎片峰的質量數和離子豐度不完全相同,但是仍有一定規律可尋。在MS分析中,所有β-內酰胺類抗生素共有的裂解反應是β-內酰胺環開裂,其他易發生斷裂的部位有7位側鏈酰胺鍵、2位碳上的羧基、氨噻肟頭孢菌素亞氨結構上的甲氧基等。

近年來,采用LC-MS分析并鑒定β-內酰胺類抗生素雜質結構的報道很多,表1總結了近20年來該類藥物的雜質結構鑒定情況。

2、氨基糖苷類藥物

氨基糖苷類藥物是由氨基環醇、氨基糖和糖組成的抗生素總稱,其化學結構都是以氨基環醇與氨基糖縮合而成的苷。氨基糖苷類抗生素易發生耳毒性損害、藥熱性死亡及腎損害,這與其相關雜質有必然的聯系。由于該類抗生素結構中不具備特征的紫外發色團,不宜采用紫外檢測器進行相關雜質研究。利用液質聯用技術鑒定該類抗生素的雜質結構,有助于分析其引起不良反應的起因。

硫酸慶大霉素是氨基糖甙類廣譜抗生素,由小單孢菌發酵經提煉而得,含多種有效成分和雜質。林梅建立了硫酸慶大霉素LC-MS 方法,根據質譜碎片并結合相關文獻,推斷出硫酸慶大霉素產品中含有加納糖胺、慶大霉素A3、慶大霉素X2、慶大霉素B、慶大霉胺C2、JI-20A、Ⅶ-3、慶大霉胺C2a、慶大霉素B1和西索霉素等有關物質,為硫酸慶大霉素實際生產和質量控制提供科學依據。楊昊等建立高效液相色譜-電噴霧-離子阱色譜法(HPLC-ESI-IT-MSn)法研究慶大霉素C1a 原料中的雜質譜,明確了慶大霉素C1a樣品中含有慶大霉素A、慶大霉素B、西索米星、小諾霉素、威達米星或它們的同分異構體和同系物,并含有慶大霉素C1a 或上述雜質的降解產物。

硫酸奈替米星為半合成的氨基糖甙類抗生素,抗菌譜與慶大霉素相似。袁耀佐等應用高效液相色譜-電噴霧-離子阱質譜法快速鑒定出硫酸奈替米星樣品中7個有關物質的結構,分別為西索米星、去甲基西索米星、1-N-乙基-加洛糖胺、5-O-乙基-奈替米星、2'-N-乙基-奈替米星、3″-N-乙基-奈替米星和3-N-丙基-依替米星。

小諾霉素又稱相模霉素或沙加霉素,是由小單孢菌產生的氨基糖苷類抗生素,是慶大霉素C2b組分。袁耀佐等用寬pH 范圍的Gemini NX C18 (4.6mm×150 mm,5 μm)色譜柱,采用診斷碎片離子推斷策略的結構推定方法,從硫酸小諾霉素原料中檢出15個有關物質,并對其中的14 個物質結構進行歸屬。

3、四環素類藥物

四環素類藥物是一類以含有四個芳香環的并四苯為結構基礎的廣譜抗生素,由于藥物本身的結構特點,其對各種氧化劑、酸和堿都不穩定。該類抗生素在生產和貯存過程中以及進入環境后發生降解會產生一些代謝和降解產物,主要是差向異構體和脫水產物。李秀琴等采用超高效液相色譜-高分辨飛行時間質譜(UPLC-HRTOF/MS)鑒定出四環素中的4 種雜質,分別為差向四環素、金霉素、差向脫水四環素和脫水四環素。

多西環素又名強力霉素或脫氧土霉素,是一種多以土霉素作為起始原料的半合成抗生素。楊帆等[29]利用LCMS-IT-TOF/MS質譜儀獲得多西環素雜質F的[M+H]+ 為m/z 444.165 4,MS3、MS4、MS5 前體離子為m/z 366.136 4、293.080 7、278.067 2,推測出其可能的質譜裂解途徑和分子結構。張錦琳等應用在線脫鹽-高效液相色譜-離子阱-飛行時間質譜(2D-LC-IT-TOF/MS) 法鑒定4個鹽酸多西環素片的有關物質結構,分別為4-表多西環素、美他環素、β-多西環素、2-乙酰-6-脫碳酰胺多西環素。

金霉素是由鏈霉菌產生的一種四環素類抗生素,主要作為獸用抗生素大量使用。方東升應用液相色譜-電噴霧離子化質譜法分析飼料級金霉素樣品的雜質組分,并根據各組分的準分子離子峰[M+H]+鑒定出該樣品中含有四環素、差向異構四環素和差向異構金霉素雜質等組分。

4、大環內酯類藥物

大環內酯類藥物按其母核結構,主要可分為十四元環和十六元環兩大類:前者主要為紅霉素及其衍生物,后者主要為螺旋霉素和吉他霉素的衍生物。大環內酯類抗生素雜質基本保留了原藥分子的骨架結構,因此大多具有相似的質譜裂解途徑、中性丟失(H2O、CH3OH 等)和碎片離子(糖基片段、內酯環片段等)。

許卓妮等通過Orbitrap Elite 高分辨質譜儀對阿奇霉素降解產物進行高分辨元素組成分析和二級質譜的測定,研究其中4個主要降解產物并推測其結構,認為阿奇霉素經酸降解和高溫破壞得到的雜質主要是去氧糖胺基阿奇霉素,經氧化降解的雜質主要是阿奇霉素-N-氧化物,經堿破壞的主要產物為內酯環開環水解、脫水或糖基片段丟失。

Wang等[35]采用《中國藥典》2010年版項下的液相色譜條件、正電離模式的電噴霧離子源串聯質譜法對乙酰螺旋霉素中的未知組分進行解析,共檢出主組分在內的83種組分,其中包括31種新雜質和31種部分解析的雜質 (異構體或者糖基變異);主要雜質來源于起始原料和合成工藝。

Leonard等利用高效液相色譜-質譜聯用法檢測克拉霉素原料藥中的11種有關物質,通過二級質譜和三級質譜的碎片離子信息,確定各相關化合物的結構,其中包括9 位羰基碳被氮原子取代形成的雜質。

Chitneni等利用高效液相色譜-質譜聯用法鑒定紅霉素降解雜質的結構,其中紅霉素經酸降解時6、9位和9、12位連接成環,形成脫水紅霉素C雜質,經堿降解時內酯環斷裂形成偽紅霉素E烯醚雜質。

vanden Bossche等利用液質聯用儀鑒定出交沙霉素中的18個有關物質,其中包括羥基移到13位產生的雜質,還有雙鍵位置在9、10位和11、12位分別產生的雜質。

5、喹諾酮類藥物

喹諾酮類,又稱吡酮酸類或吡啶酮酸類,是一類含4-喹諾酮基本結構的人工合成抗菌藥。該類藥物的不良反應在很大程度上與藥物的母核結構、取代基的種類和取代位置等相關。對喹諾酮類藥物中雜質進行系統的分析研究,鑒定其結構,對提高雜質控制標準,保證臨床療效和病人用藥安全均有重要的意義。

王維劍等通過HPLC-MS對左氧氟沙星經酸、氧化、光照破壞的樣品進行分析,結果發現左氧氟沙星酸降解產物為去羧基左氧氟沙星,氧化降解產物為左氧氟沙星-N-氧化物,兩個光照降解產物分別為去甲基左氧氟沙星、左氧氟沙星-N-氧化物。

鄭亞杰采用LC-HRMS/MS聯用技術,建立適用于喹諾酮類藥物中微量或未知雜質的整合性結構分析方法,對左氧氟沙星、環丙沙星和莫西沙星經強制破壞試驗處理后的樣品進行綜合分析,并鑒定出5個左氧氟沙星相關雜質的結構。另外,該研究對莫西沙星和環丙沙星等一批代表性的喹諾酮類藥物,以及經過強制破壞試驗處理后的樣品進行綜合分析,一共鑒定出5個莫西沙星相關雜質和13個環丙沙星相關雜質的結構。

賀玖明等采用高分辨液相色譜(RRLC)對莫西沙星原料在30% H2O2 中的氧化降解產物進行分離,分別設定高低碰撞能量的TOF-MS實驗采集質譜數據,獲取母離子與碎片離子等質譜信息,從而得到10個該藥物降解雜質的結構及相對含量。

黃婧等采用高效液相色譜-三重串聯四極桿質譜聯用儀測定依諾沙星的有關物質準確母離子及子離子,并結合裂解規律、對照品和依諾沙星生產工藝,對3種主要有關物質進行結構推定,認為三者均具有依諾沙星的1,8-萘啶母核結構。

6、沙坦類藥物

沙坦類藥物即血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑類抗高血壓藥物,是繼血管緊張素轉化酶抑制劑之后的一類新型降壓藥。沙坦類藥物的雜質研究多是通過HPLC法進行。近年來,隨著液質聯用技術的應用越來越廣泛,分析并鑒定該類藥物雜質結構的報道越來越多。

纈沙坦是由瑞士諾華公司開發,1996年獲美國FDA 批準,是目前全球處方量最大的沙坦類藥物。劉朝霞等對8個廠家的175批纈沙坦膠囊進行有關物質的檢測分析,并采用LC-MS/MS技術分析推斷出纈沙坦雜質F的結構,命名為纈沙坦乙酯。王燕等采用LC-MS/MS法對復方纈沙坦氨氯地平片中有關物質進行定性分析,并根據有關物質的PDA 譜、質譜母離子及子離子譜進行解析,鑒別出11個復方纈沙坦氨氯地平片中有關物質的結構。

吳強等采用四級桿復合線性離子阱液質聯用儀對阿齊沙坦的光降解產物和酸降解產物進行結構推測,鑒定出光降解主要產物為1-( ( 2'-1H-雙吖丙啶-3-基-[1,1'-聯苯]-4-基) 甲基)-2-乙氧基-1H-苯并[d]咪唑-7-羧酸,酸降解主要產物為2-氧代-3-(( 2'-(5-氧代-4,5-二氫-1,2,4- 噁二唑酮-3-基)-[1,1'-聯苯]-4-基)甲基)-2,3-二氫-1H-苯并[d]咪唑-4-羧酸。

方玉玲等采用液相色譜-光電二極管陣列檢測器-四極桿飛行時間質譜聯用(LC-PDA-QTOF--MS) 對氯沙坦鉀中工藝雜質進行結構確認及分析,確定氯沙坦鉀成品質量的RRT 1.12雜質為氯沙坦羧酸衍生物,該雜質產生的主要原因是反應過程中關鍵原料氯腈進行四氮唑反應不完全,在后處理過程中水解產生的。

7、其他藥

隨著液質聯用技術不斷地成熟,在進行雜質譜研究的過程越來越多的研究者更傾向于利用該技術進行結構鑒定。彭玉薇等采用高效液相色譜離子肼質譜串聯技術在線鑒定氨氯地平原料藥中未知雜質的結構,得到3個未知雜質分別為二甲酯式氨氯地平、甲酯異丙酯式氨氯地平、異丙酯乙酯式氨氯地平。庾莉菊等采用超高效液相色譜-三重四極桿質譜聯用技術(UPLC-MS/MS)對青蒿素樣品中的主要雜質進行結構確認,其中雜質Ⅰ為青蒿烯,雜質Ⅱ可能為青蒿素的異構體。熊婧等采用超高壓液相-質譜(UPLC-MS)聯用技術鑒定鹽酸芐絲肼中的未知雜質為鹽酸三羥芐基芐絲肼。彭琳等采用液質聯用-電噴霧負離子模式,通過比較雜質和對照品的質荷比對注射用蘭索拉唑的雜質進定性研究。吳川彥等采用高效液相-飛行時間-質譜法(HPLC-Q-TOF-MS)對米諾地爾及凝膠有關物質的分析,推斷出8個雜質的結構,均為新發現的降解產物。

8、展望

液質聯用技術將高分離能力的色譜技術和高定性能力的質譜技術相結合,不但擁有色譜法的優點,還彌補了色譜法的一些不足。該技術在使用色譜法對藥物中的有關物質進行有效分離的基礎上,進一步利用一級、二級甚至多級質譜碎片信息推測其有關物質的結構,提高定性能力,避免傳統的分離、制備等較為繁瑣的前處理過程,更有利于多組分的藥物識別。隨著液質聯用技術的不斷進步,該技術已成為能夠快速準確地發現及鑒定藥物中雜質結構的最優方法。

液質聯用技術盡管在藥物及雜質分析領域表現出一定的優勢,但在實際的應用中同樣也存在一定的問題與不足,需要進一步的完善。該技術在通過二級或多級質譜碎片信息進行結構推導時,無法對結構中部分基團的位置或空間構型進行確定;而且得到的質譜信息量大,需要較為繁瑣的數據處理過程,尚未有較為全面的數據庫可查詢,這是利用該技術進行結構鑒定的一個缺陷。由于雜質在樣品中含量極微,用富集的制備方法獲得雜質精制品的工作量大,甚至還需要特殊的設備,成為藥物雜質譜研究的瓶頸所在。期待有更先進的分析手段來加速發展并推動這方面工作的深入研究。